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1、123基因工程的一般流程 目的基因的获取 载体的构建 体外重组 导入宿主细胞 筛选及鉴定重组子4基因工程中常用的工具酶1.限制性内切酶2.连接酶3.末端修饰酶 5基因克隆载体的概念：基因工程中常用的载体6严紧型质粒和松弛型质粒蓝-白斑筛选（1）穿梭质粒载体（shuttle vector）：（4）柯斯质粒载体（5）YAC BAC7目的基因片段的获取1 目的基因的来源2 获得目的基因的途径2.1 限制性酶切法；2.2 PCR法；2.3 化学合成法；2.4 基因组文库或cDNA文库法；8重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环
2、需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。电泳9转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体内稳定维持和表达的过程。转染：如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA,则把此过程称为转染。 转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。10抗性筛选、蓝白斑筛选、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp，111 根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子2 根
3、据目的基因转录产物（mRNA）鉴定重组子 Northern杂交 RT-PCR：3 根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定重组子Western12基因工程的一般步骤(目的基因未知）13 第一节 细胞工程基本知识与基本技术 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 微生物细胞工程141. 植物组织培养的基本过程：预备阶段：诱导去分化阶段：继代增殖阶段：生根发芽阶段：移栽成活阶段:2.1 15化学或物理法诱导完全杂合、核质异源杂合体的鉴别与筛选酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定取材与除菌162.3 人工种子用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。17人工种
4、子人工种子 解决有些植物结子困难、发解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题芽率低、繁殖困难等问题18制作过程胚乳与褐藻酸钠混合后，加入胚状体，滴入到硝酸钙或CaCl2中，2分钟后，表面聚合，形成人工种子191. 动物细胞、组织培养技术生长特点：贴壁生长，接触抑制细胞株 细胞系20 2. 动物细胞融合技术动物细胞融合的途径： 病毒诱导、化学诱导、电激诱导单克隆抗体 单克隆抗体的制备过程 3.技术21合成抗体体外增值223.微生物细胞工程细胞融合技术概括起来主要包括制备原生质体，诱导细胞融合，筛选杂合细胞 2324一、发酵工程概况：现代发酵工程的定义;发酵周期；放罐时间二、发酵过程： 发酵
5、类型：菌体；酶；代谢产物；转化；生物工程菌培养基原料 培养基配制 培养基灭菌 菌体储备菌种 摇瓶 种子罐 生产罐 培养 细胞分离 无细胞上清液 产品抽提 产品精制 产品包装25三、液体深层发酵：液体深层发酵的操作方式（分批发酵；连续发酵；补料分批发酵）；各自优缺点；发酵过程主要影响参数四、发酵设备(发酵罐）： 26酶反应器发酵生产的优点、菌种筛选、发酵方式、提高酶产量的措施酶的制备技术酶的纯化与精制固定化酶 (细胞)的优点、固定化方法酶分子的改造技术酶反应器基本类型、生物传感器酶工程的概念和基本过程（酶的分类）27提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂28酶的制备技术(破碎细
6、胞、溶剂抽提、离心分离、过滤 、浓缩、干燥); 纯化与精制的方法（酶分子大小、电荷性质、专一性结合特性）；酶分子的修饰方法29固定化酶（细胞）的优点（不溶于水，便于分离；能回收、反复使用；稳定性；生产自动化；但不会持续维持生产能力逐渐提高）酶固定化方法（载体结合、共价交联、包埋）细胞固定化方法（直接法，包埋法，物理吸附法）30酶生物合成的模式通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。 31v蛋白质工程概念，表达体系、设计目标蛋白质工程研究的技术和方法：NMR32目前蛋白质工程研究的主要领域，研究程序一般如下： （1）分离纯化得
7、到0.11.0mg纯目的蛋白质（2）测定其部分肽段的一级结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针 （3）利用该探针从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因33（4）通过表达载体获得较大量(0.11.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案 （5）基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子 34蛋白质组学（Proteomics） “Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学（Proteomics)：以蛋白质
8、组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的一门科学领域。功能蛋白质组（Functional Proteome)：指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组学（Functional Proteomics）：研究细胞内与某种功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。35双向电泳技术 第一向等电聚焦（IEF）电泳：利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质的电泳方法。用缓冲液水化 第二向SDS-PAGE：SDS，巯基乙醇，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，样品中的蛋白质成分按照蛋白质分子量的大小加以分离。 通过染色，进行蛋白质
9、计算机软件分析。 367.1 生物技术与人类健康（人生长激素释放抑制剂激素、基因治疗）7.2 生物技术与环境 （生物修复）7.3生物技术与能源生物技术在上述各领域的应用或对人类社会的影响37基因工程中常用的工具酶1.限制性内切酶2.连接酶3.末端修饰酶 38目的基因片段的获取1 目的基因的来源2 获得目的基因的途径2.1 限制性酶切法；2.2 PCR法；2.3 化学合成法；2.4 基因组文库或cDNA文库法；39 第一节 细胞工程基本知识与基本技术 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 微生物细胞工程4041酶反应器发酵生产的优点、菌种筛选、发酵方式、提高酶产量的措施酶的制备技术酶的纯化与精制固定化酶 (细胞)的优点、固定化方法酶分子的改造技术酶反应器基本类型、生物传感器酶工程的概念和基本过程（酶的分类）42提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂