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1、章晓联 教授武汉大学医学院免疫学系流式细胞仪流式细胞仪FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER原理及应用原理及应用流式细胞术流式细胞术 流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展、综合的结晶。算机技术等学科高度发展、综合的结晶。流式细胞仪的应用标志着细胞学、肿瘤学、免流式细胞仪的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究疫学等进入了细胞和分子水平的研究.一、一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理流流式式细细胞胞术术(
2、FCM,FlowCytometry):是是对对单单个个细细胞胞或或其其他他生生物物微粒进行快速微粒进行快速定性定性,定量分析与分选定量分析与分选的一门技术的一门技术。FCM是利用流式细胞仪是利用流式细胞仪(FlowCytometer)分析在高压高速下分析在高压高速下通过样品孔径的单个细胞通过样品孔径的单个细胞,在激光束的照射下的发出的在激光束的照射下的发出的散射光散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的荧光信号荧光信号。流式细胞仪与显微镜流式细胞仪与显微镜FLOWMICROSCOPE光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖
3、)玻片鞘液及流动室检测信号 光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜,光学放大统计人工，200计算机，5000结果简单，单参数多参数，综合分析F二二 样品的制备和数据的收集样品的制备和数据的收集F流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮液液,凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的使用使用。全血或全血或Ficoll-Hypaque分离的单核细分离的单核细胞胞,用标记的单抗染色用标记的单抗染色,裂解红细胞裂解红细胞然后在然后在流式细胞仪上流式细胞仪上,通过包被细胞的液流的鞘液通过包被细胞的液流的鞘液进行分析进行分析。流流路路
4、F 单细胞悬液F 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 F这一过程,成为流体动力学聚焦FLOWCELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluidATOMF每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长。F利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号。光路光路-荧光信号荧光信号常用荧光染料FITC=fluorescein isothiocyanate(异硫氰酸呱荧光素异硫氰酸呱荧光素)PE=phycoerythrin(RD1)(藻红蛋
5、白藻红蛋白)ECD=energy coupled dye(藻红蛋白藻红蛋白-德州红德州红)PI=propidium iodide(碘化丙啶碘化丙啶)PC5=phycoerythrin cyanin 5(PeCy5)(藻红蛋白藻红蛋白-花青苷花青苷5)ultra-violet blue greenyellow orange red infra-violet redFITC520PE575ECD 615PC5665LASER 488PI620400-450 l450-500 l500-570 l 570-590 l750 l4ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/P
6、C5常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP 488670APC633670检测信号检测信号散射光信号散射光信号FS:前向角散射光前向角散射光SS:侧向角散射光侧向角散射光(90度散射光度散射光)荧光信号荧光信号荧光染料荧光染料光学滤片光学滤片荧光信号荧光信号的分析的分析:是利用荧光染料或荧光素标记的单抗是利用荧光染料或荧光素标记的单抗(如异硫氰基
7、荧光素如异硫氰基荧光素fluoresceinisothiocyanate,FITC,绿色绿色荧光荧光;藻红蛋白藻红蛋白PE(phycoreythrin),红色荧光红色荧光),检测结检测结合单抗的单个细胞发射的荧光信号合单抗的单个细胞发射的荧光信号。流式细胞仪的参数流式细胞仪的参数:(1)散射光散射光FSC:细胞的大小和尺寸细胞的大小和尺寸;(2)散射光散射光SSC:细胞内颗粒物质的大小和多少细胞内颗粒物质的大小和多少;(3)荧光参数荧光参数:荧光染料或荧光抗体荧光染料或荧光抗体散射光散射光:与细胞的大小和细胞的内容物及其复杂性相关与细胞的大小和细胞的内容物及其复杂性相关.大细胞产生更多的大细胞
8、产生更多的FSC(forwardlightscatter,前向角散射前向角散射);细胞的内容物更复杂的细胞的内容物更复杂的(如含颗粒如含颗粒,线粒体等线粒体等)产生更多的产生更多的SSC(SSC，SideScatter,侧向角散射侧向角散射)。NeutrophilsMonocytesLymphocytesLight Scatter Gating流式细胞仪的测定数据表示流式细胞仪的测定数据表示:(1)(1)单单参参数数直直方方图图:以以细细胞胞数数为为纵纵坐坐标标,以以FSC,FSC,SSC,SSC,FL1,FL2FL1,FL2等为横坐标等为横坐标;(2)(2)双双参参数数二二维维点点图图:以以
9、FSC,FSC,SSC,SSC,FL1,FL2FL1,FL2等等中中两两个个参参数数为为X,YX,Y轴轴,在二维点图每个点代表一个细胞在二维点图每个点代表一个细胞;(3)(3)三三参参数数三三维维图图:任任选选一一个个参参数数为为X,Y X,Y 轴轴,再再以以细细胞胞数数或或参数为参数为Z Z轴轴。SingleParameterHistogramDNA含量直方含量直方图图和抗原表达直方和抗原表达直方图图单参数直方图单参数直方图Dual Parameter HistogramsLog FITC Fluorescence(CD8).1 1 10 1001000123445%2%26%27%双参数二
10、维点图双参数二维点图3-DHistograms三参数三维图三参数三维图四四 流式细胞仪在医学和生流式细胞仪在医学和生物学中的应用物学中的应用 细胞生物学细胞生物学 临床免疫学临床免疫学 临床血液学临床血液学 临床肿瘤学临床肿瘤学 细胞凋亡细胞凋亡 血栓与止血血栓与止血 骨髓和器官移植骨髓和器官移植 基础医学研究基础医学研究1.FCM 1.FCM 在细胞生物学中的应用在细胞生物学中的应用:(1)(1)细细胞胞周周期期分分析析:DNADNA和和RNARNA特特异异性性染染料料有有PI,PI,EBMI,EBMI,CA3,CA3,HO.33258,HO.33258,HO.33342,HO.33342,
11、DAPI,DAPI,7-AAD,7-AAD,AOAO和和PYPY等等.通通过过抗抗溴溴脱脱氧氧脲嘧啶核苷脲嘧啶核苷(BrdUrdBrdUrd)的单克隆抗体也可对的单克隆抗体也可对DNADNA进行染色进行染色。(2)(2)细细胞胞内内钙钙离离子子浓浓度度测测定定:荧荧光光染染料料(如如Quin-2,Quin-2,Indo-1,Indo-1,Fura-2,Fura-2,Fluo-3 Fluo-3 和和Rhod-2Rhod-2等等)通通过过乙乙酰酰甲甲脂脂(AE)(AE)导导入入细细胞胞后后,与钙离子特异性结合与钙离子特异性结合.故测荧光强度可得到钙离子浓度的相对值故测荧光强度可得到钙离子浓度的相对
12、值。(3)(3)细细胞胞内内pHpH值值测测定定:荧荧光光染染料料(BCECF,(BCECF,COFDA,COFDA,DCHDCH等等)激激发发光光谱谱或或发发射射光光谱谱是是pHpH值值依依赖赖的的.在在生生理理pHpH值值范范围围内内,比比例例荧荧光光与与pHpH值有很好的线性关系值有很好的线性关系。2.FCM在免疫学中的应用在免疫学中的应用:(1)各种免疫细胞的表面标志各种免疫细胞的表面标志,细胞分选等细胞分选等;(2)细胞内各种细胞因子的检测细胞内各种细胞因子的检测;(3)HLA群体分型群体分型;(4)细胞增殖细胞增殖CFSE法：活体染料羧基荧光素酰乙酸法：活体染料羧基荧光素酰乙酸（C
13、arboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，CFDA-SE）是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并）是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成具有绿色荧光的氨基反应性羧在细胞内被酯酶转化成具有绿色荧光的氨基反应性羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。）。CFSE只有当细胞只有当细胞发生分裂时，才会平均地分配到子代细胞中。因此发生分裂时，才会平均地分配到子代细胞中。因此CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。免疫细胞的表面标志，淋巴细胞亚群分析免疫细胞的表面标志，淋巴细胞亚群分析举例
14、说明举例说明:正常人外周血细胞的分析正常人外周血细胞的分析:在在R1 R1 lymphocyteslymphocytes区区,分分析析T/BT/B细细胞胞的的表表面面标标记记:70%70%是是CD3+T;CD3+T;30%30%是是CD3-,CD19+BCD3-,CD19+B细胞细胞在在T T细胞中细胞中,分析分析 CD4+T,CD8+TCD4+T,CD8+T 在在B细胞中细胞中,k k和和l l各占各占50%50%在在R2monocytes区区,均是均是CD14+,CD45+在在R3granulocytes区区,均是均是CD13/33+,CD45+3.3.细胞凋亡的细胞凋亡的FCMFCM检测
15、检测 Apo 27Apo 27Apo 27Apo 27：利用早期细胞凋亡时线粒体功能紊乱的特征性标记物利用早期细胞凋亡时线粒体功能紊乱的特征性标记物利用早期细胞凋亡时线粒体功能紊乱的特征性标记物利用早期细胞凋亡时线粒体功能紊乱的特征性标记物Apo2.7Apo2.7检测检测检测检测 TUNELTUNELTUNELTUNEL：分子生物学与形态学相结合的晚期凋亡检测法分子生物学与形态学相结合的晚期凋亡检测法分子生物学与形态学相结合的晚期凋亡检测法分子生物学与形态学相结合的晚期凋亡检测法 AnnexinAnnexinAnnexinAnnexin ：利用细胞早期凋亡时细胞膜表面结构及成份的变化进行检利用
16、细胞早期凋亡时细胞膜表面结构及成份的变化进行检利用细胞早期凋亡时细胞膜表面结构及成份的变化进行检利用细胞早期凋亡时细胞膜表面结构及成份的变化进行检测测测测 CaspaseCaspaseCaspaseCaspase(半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶)：以细胞凋亡信号通路中的蛋白以细胞凋亡信号通路中的蛋白以细胞凋亡信号通路中的蛋白以细胞凋亡信号通路中的蛋白作为标志物来检测作为标志物来检测作为标志物来检测作为标志物来检测FCMFCM分析细胞凋亡分析细胞凋亡:AnnexinAnnexin 磷脂结合蛋白作为探磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨
17、酸细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（部的磷脂酰丝氨酸（PSPS）可以迁移到细胞外层表面。可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的PSPS将凋亡细将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。引起的炎症反应。AnnexinAnnexin 是一种是一种CaCa离子依赖的，离子依赖的，对对PSPS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有别细胞膜是否有PSPS，识别凋亡
18、细胞，由于坏死细胞识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现也可能在膜表面出现PSPS，故需要同时进行染料故需要同时进行染料（PIPI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。SchematicrepresentationoftheAnnexinVassayFCMFCM分析细胞周期和凋亡分析细胞周期和凋亡:根据细胞根据细胞DNADNA含量的改变含量的改变 凋亡细胞凋亡细胞DNADNA的降解的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使的活性增强，使DNADNA分裂成一些小片段，这些小分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞
19、外，使凋片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的亡细胞的DNADNA含量相对减少含量相对减少，与荧光染料的结合与荧光染料的结合减少减少,故细胞故细胞DNADNA荧光强度降低荧光强度降低;DNA;DNA直方图上显示直方图上显示在在G0/G1G0/G1峰前出现一个峰前出现一个DNADNA含量减少的亚二倍体或含量减少的亚二倍体或称亚称亚G0/G1G0/G1峰峰,又称凋亡峰又称凋亡峰.通过通过DNADNA含量可同时含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。研究凋亡细胞的周期特异性。利用特殊的利用特殊的荧荧光染料光染料(PI(PI、EBEB、AOAO等等)与细胞内与细胞内DNADNA碱基结合，被碱基
20、结合，被荧荧光染料染光染料染色的细胞在激光照射下发色的细胞在激光照射下发射出射出荧荧光，荧光强度与光，荧光强度与DNADNA含量成正比。流式细含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的强度推算出细胞的DNADNA含含量量.细胞细胞DNADNA分析原理分析原理细胞周期与细胞周期与DNADNA的倍体关系的倍体关系G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2N2N4N4NNormalCellCycle4.临床疾病的诊断及治疗依据临床疾病的诊断及治疗依据(
21、2)(2)机体免疫功能监测的应用例子：机体免疫功能监测的应用例子：自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊 柱炎相关标志变态反应性疾病变态反应性疾病变态反应性疾病变态反应性疾病CD23:与变态反应严重程度呈正相关(1)(1)FCMFCM在血液在血液,肿瘤学中的应用肿瘤学中的应用;如白血病如白血病,(2)(2)淋巴细胞瘤的诊断和分类淋巴细胞瘤的诊断和分类,肿瘤的监控肿瘤的监控;(3)(3)在药理学中的应用在药理学中的应用.(3)(3)器官移植后免疫监测器官移植后免疫监测 提示排异提示排异-CD3+/CD25+-CD3+/CD25+基线基线5-10%5-10
22、%以上以上 提示肾穿提示肾穿-CD3+/CD25+-CD3+/CD25+持续增加持续增加 预测感染预测感染-CD4/CD8-CD4/CD8比值下降比值下降 指导免疫抑制剂应用指导免疫抑制剂应用-CD4/CD80.2-CD4/CD80.2必须停药必须停药 提示提示MCVMCV感染感染-CD3+/HLA-DR+-CD3+/HLA-DR+增加增加5-10%5-10%不伴不伴CD25CD25增加增加(4)AIDS(4)AIDS 诊断及治疗监控诊断及治疗监控标本的制备免疫标记（免疫标记（膜表面膜表面)的样本处理的样本处理保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。
23、300目尼龙网过滤目尼龙网过滤调整细胞浓度：调整细胞浓度：25X106/ml，标记：取标记：取100ul样本样本+适量抗体适量抗体孵育：室温避光孵育：室温避光20分（或根据抗体说明）分（或根据抗体说明）（加二抗）（加二抗）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）检测：检测：标本的制备标本的制备免疫标记（免疫标记（细胞浆内细胞浆内)的样本处理的样本处理 先将细胞膜先将细胞膜“打孔打孔”-破膜破膜破膜剂的选择：破膜剂的选择：Triton 皂素皂素 毛地黄毒甙毛地黄毒甙按前述方法进行标记按前述方法进行标记标本的制备标本的制备 细胞周期分析的样本处理细胞周期
24、分析的样本处理传统方法：传统方法：单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）冰乙醇固定过夜冰乙醇固定过夜洗涤细胞洗涤细胞加复合染液（加复合染液（TritonTriton，RNARNA酶、酶、PIPI）20-3020-30分钟后上机检测分钟后上机检测BCBC公司公司DNA-PrepDNA-Prep试剂试剂溶血（如需要）溶血（如需要）固定染色一步完成固定染色一步完成2020分钟后上机检测分钟后上机检测FCM对照设置1.阳性对照：使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素造成的假阴性结果。2.阴性对照（1）空白对照：由于存在自发荧光，即
25、不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光，需要设立空白对照来去除自发荧光信号（噪声信号）。（2）同型阴性对照：就是将空白对照样品用同型对照抗体标记，用于排除非特异性染色和自发荧光。是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光标记法染色，同型对照也应标记荧光素。（3）补偿对照（双色或多色分析时）F荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。需要将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色，几色分析就需要制备几个补偿对照管F选择荧光抗体选择荧光抗体F常用的多色组合：FFITCPE：最常用的双色组合;FFITCPEPE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小;FFITCPEPerCP+APC：最常用的四色组合.F一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上，而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上。思考题F1.试述流式细胞仪的原理,主要检测信号和参数;F2.举例说明流式细胞仪的应用。