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1、第六章第六章 流式细胞技术的原理与应用流式细胞技术的原理与应用Flow Cytometry山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院 杨桂文杨桂文一、流式细胞仪概述一、流式细胞仪概述 流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。所谓流式细胞术流式细胞术，就是利用流式细胞仪对细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。流式细胞仪分为三大类：流式细胞仪分为三大
2、类：台式机，临床型台式机，临床型，特点：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学掌握。大型机，科研型，大型机，科研型，特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛灵活的科学研究。新型流式细胞仪，新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测13个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数同时分析。还可以实验现高速分先，速度达到50000个/s，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。液流系统液流系统光学系统光学系统电子系统电子系统分选系统
3、分选系统二、流式细胞仪的结构组成二、流式细胞仪的结构组成Principles of Flow Cytometric analysis三、流式细胞仪的基本结构三、流式细胞仪的基本结构液液流流系系统统液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。光学系统光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束-激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。光光学学系系统统分
4、分选选系系统统Fluorochrome specification电子系统负责光电转换和数据处理电子系统负责光电转换和数据处理1 散散 射射 光光 信信 号号激发光光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群侧向角散射光（SSC）Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性前向角散射光（FSC）Forward Scatter：细胞相对大小及其表面积外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）白细胞白细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞 粒细胞粒细胞 根据散射光信号根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：从人白细胞中鉴别出不同亚群：流式细胞仪的信号分析流式细胞仪的信号分析流式细胞仪的
5、信号分析流式细胞仪的信号分析2 荧荧 光光 信信 号号利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析：检测多种细胞表面标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平 为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群荧荧 光光 信信 号号 的的 分分 析析流式细胞仪的信号分析流式细胞仪的信号分析 数据存储数据存储:LIST MODE数据显示数据显示:直方图直方图 (Histogram)(Histogram)二维点图二维点图(Dot Plot)(Dot Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)(Contour Plot)密度图密度图 (Density)(Density)三维图（三维图（3
6、D Plot3D Plot）等）等流式细胞仪的数据分析流式细胞仪的数据分析=点图分析点图分析流式细胞仪的数据分析流式细胞仪的数据分析流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式流式细胞胞仪通常以激光作通常以激光作为发光源。光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射聚焦整形后的光束，垂直照射在在样品流上，被品流上，被荧光染色的光染色的细胞在激光束的照射下
7、，胞在激光束的照射下，产生散射光和激生散射光和激发荧光。光。这两种信号同两种信号同时被前向光被前向光电二极管和二极管和9090方向的光方向的光电倍增管接收。光倍增管接收。光散射信号在前向小角度散射信号在前向小角度进行行检测，这种信号基本上反映了种信号基本上反映了细胞体胞体积的大小；的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射一系列双色性反射镜和和带通通滤光光片的分离，形成多个不同波片的分离，形成多个不同波长的的荧光信号。光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，
8、将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后
9、振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。流流 式式 仪仪 器器 一一 览览BD-流式技术的先锋流式技术的先锋全球第一台流式细胞仪 FACS I（1973）全球第一台全自动4色流式细胞仪 FACSCalibur全球第一台免校准,双激光6色流式细胞仪 BD LSR 落地式流式细胞分选仪 FACSVantageSE全球第一台高速流式细胞分选仪 FACSAria经济普及型流式细胞仪 FACSCount Marke
10、t share of BD FCM：worldwide 75%，China 70%流式细胞仪一览流式细胞仪一览流式细胞仪一览流式细胞仪一览BD FACSAriaBD FACSCaliburBD FACS VantageSEBD LSRBD 流式机型特点/优势FACSAria 固定光路校准技术，无需每日调整光路 三根激光：488nm/633nm/407nm 一次同时分选2/4群不同特性细胞 单激光7色荧光1散射光信号 三激光13色荧光2散射光信号FACSCalibur 世界上分析速度最快的台式机（104细胞/秒）独特的分送和浓缩系统，大大提高细胞回收率 双激光：488nm/635nm 四色荧光2
11、散射光信号BD LSR 可三根激光：488nm/325nm/(633)nm 固定校准，6色荧光2散射光信号 分担落地型FCM分析工作，使之专门用于分选细胞FACSVantageSE 双激光：488nm/UV 6色荧光2散射光信号 高速分选分选：2.5万细胞/秒NewCommon流式细胞仪一览流式细胞仪一览流流 式式 应应 用用 一一 览览流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期蛋白质含量RNA含量细胞功能细胞功能细胞表面/胞浆/核内特异性抗原细胞活性和酶活性细胞因子和受体激素结合位点胞内钙离子浓度流式分析应用一览流式分析应用一览流式分析应用一览流式分析应用一览流流式式细细胞胞仪仪的的临临床床应应用用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病流流式式细细胞胞仪仪的的科科研研应应用用 树突状细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 流式细胞术与分子生物学研究流式分析应用一览流式分析应用一览