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1、第二章 微生物工业的菌种第一节第一节 菌种的分离简介菌种的分离简介 一、菌种的来源一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买从大自然中分离筛选新的微生物菌种 二、分离思路二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。定定方方案案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增
2、殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新菌种分离与筛选的步骤三、新菌种分离与筛选的步骤（一）、含微生物材料的选择 土壤 海洋 生物体内 极端环境和特殊的生态环境一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主;富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多;植物体中富含菌物;海水中富含酵母菌;极端环境和特殊的生态环境:细菌,放线菌和酵母菌从自然界筛选从自然界筛选1、采样季节：对细菌和放线菌以
3、温度适中，雨量不多的秋初为好;对菌物在植物生长季节均适合。2、采样方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。3、为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。大型菌类尽可能在野外分离（二）、材料的预处理 热处理法 膜过滤法 化学药品处理 用0.01N的NaOH处理样品，可分离得到小单孢菌。用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。（三）选择性培养（三）选择性培养 为了容易分离到所需目的菌种，让无关的微生物至少是在
4、数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（四）、分离、筛选方案的设计 筛选模型 加选择压力 诱饵法、富集培养 反应特性 随机分离筛选模型 例如:在抗生素的筛选过程中，为避免致病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌而又能代表致病菌的其它微生物作为试验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛选模型。诱饵法：在分离样品或培养基中加入一些特殊的营养物，待菌生长一定
5、时间后，再进行分离。如将涂石蜡的棒置于培养基中，可分离到诺卡氏菌。富集培养：指能增加混合菌群中所需菌株的一种技术，方法是在混合菌群中提供有利于所需菌株生长或不利于其它微生物生长的条件。反应特性：如分离蛋白酶，在不溶性蛋白的平板上可产生一清晰的透明圈，透明圈的大小可作为选择的依据。随机分离：制备一系列培养基，其中各种类型的养分成为限制因子。避免使用容易同化的碳、氮源，因为它们可能产生分解代谢物阻遏。（五）培养分离（五）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有
6、划线分离法、稀释分离法等等。菌种的培养温度 放线菌：2530 嗜热菌：4555 嗜冷菌：410 时间：延长培养时间可以分离到 新的或不寻常的菌株（六）筛（六）筛 选选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。菌种筛选时应考虑的一些重要指标：1、菌的营养特性 2、菌的生长温度 3、菌对生产设备和生产过程的适应性 4、菌种的稳定性 5、容易从发酵液中提取产物 6、产物的得率高（七）毒性试验（七）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤
7、酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节、高产菌株的选育（一）、自然选育（二）、常规诱变育种（三）、合理诱变育种（四）、原生质体融合技术（五）、基因工程技术 从自然界直接分离得到的菌种，不能立即适合实际生产的需要，只有通过选育，才能提高产物的产量，改进品质，甚至简化工艺。（一）、自然选育 不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。评价（二）、常规诱变育种 利用物理、化学等诱变剂，使微生物发生突变而进行菌种选育的过程。评价诱变物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法常规诱变育种的一
8、般操作过程出发菌种原种特性考察斜面或摇瓶培养孢子液细胞液诱变剂处理稀释平板分离 以未处理的菌种液为对照，计算致死率；观察单菌落形态，统计形态变异率。选择、调取单菌落，转管保存 初筛（以出发菌种为对照）选出高产突变株，并留种保存 复筛（以出发菌种为对照）根据情况进行第二、第三复筛选出高产突变株，并留种保存选出高产突变株，并留种保存高产菌株的稳定性实验菌种特性考察 小发酵罐试验放大实验、中试考查高产菌种培养条件的优化实验大罐试验生产诱变育种应注意的几个问题 （1）、出发菌株的选择 （2）、复合诱变剂的使用 （3）、诱变剂的剂量 （4）、突变株的筛选 （5）、高产突变株培养条件的优化常用物理、化学诱
9、变剂：（1）、紫外线 （2）、快中子 （3）、高频电子流 （4）、CO-60 （5）、亚硝酸 （6）、氮芥 （7）、亚硝基胍（三）、合理诱变育种 根据微生物的代谢调节机理来选择一定类型的微生物突变株，以获得高产菌株。代谢过程是由酶催化完成的，因此代谢途径的调节也就是酶的调节。酶的调节分为：酶合成的调节酶活性的调节酶合成的调节：诱导：只有在有诱导物存在的时候，酶才能合成，这样的酶称为诱导酶。不需诱导物就能合成的酶是组成酶。诱导又分为协同诱导、顺序诱导等。阻遏:是阻止酶的合成，又有反馈阻遏、分解代谢物阻遏等。酶活性的调节：对已经存在酶的活性进行调节，分为激活和抑制。酶的激活有前体激活、补偿性激活等
10、，酶的抑制有终点产物反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制等。（1）、选育组成型菌株 （2）、选育抗反馈调节的突变株 （3）、选育营养缺陷型 （4）、选育负变菌株的回复突变株?（5）、选育条件抗性突变株 （6）、选育细胞膜透性改变的突变株 （7）、选育抗生素抗性突变株（四）、原生质体融合技术 也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质（包括核DNA和核外基因）进入另一个细胞。它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下去。原生质体融合简要说明：金色链霉菌，四环素发酵单位14000-
11、17000g/ml淡红链霉菌（正定变种1482），柔红霉素发酵单位60-80g/ml原生质体原生质体原生质体融合再生、筛选得到PF-25菌株，柔红霉素发酵单位250-300g/ml阿克拉霉素产生菌（链霉菌）诱 变突变株A不合成阿克拉霉素，但合成阿克拉霉素前体的类似物和2hydroxyaklacinoe突变株B不合成阿克拉霉素，也不合成阿克拉霉素前体的类似物，但能在2hydroxyaklacinoe上 接上糖苷原生质体融合融合子产生2羟基阿克拉霉素用原生质体技术提高发酵单位的例子产物性质菌种增产效果西索米星硫链丝菌肽碳青霉烯麦迪霉素庆大霉素头霉素C巴龙霉素种内种内种内种内种间属间种内种内种间Mi
12、cromonospora ingoensis运青链霉菌灰色链霉菌生米卡链霉菌生米卡链霉菌/灰色链霉菌小单孢菌/灰色链霉菌小单孢菌Nocardia lactamdurans 链霉菌/弗氏链霉菌10152倍10倍405倍58521556倍原生质体融合技术的优点：（1）、去除细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换和实现重组，不需要有已知的遗传操作系统 （2）、原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子 （3）、重组频率特别高 （4）、可以和其它育种方法相结合 （5）、可以用药物、温度、紫外线钝化亲株的一方，然后再进行融合，这样可以提高筛选的效率
13、 （6）、原生质体融合并不局限于种内，还可以进行种间和属间的原生质体融合（五）、基因工程技术 无论用什么方式获得的DNA分子，插入到任何载体（包括病毒、细菌的质粒或者酵母），使之形成遗传物质的新组合（即重组DNA分子），再将它们转移到一种原来并不含有这样新组合的宿主细胞中去，使宿主细胞获得新的遗传信息并稳定遗传下去，成为新型生物。一个完整的基因克隆过程包括以一个完整的基因克隆过程包括以下步骤下步骤、获得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、重组DNA分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。基因重组1、基因工程生产蛋白质及多肽类药物 蛋白质及多肽药物
14、的基因工程是生物工程中最活跃和最有成就的领域。目前应用基因工程方法生产的这类药物已投放市场的有胰岛素、干扰素、人生长激素、白介素2、促红细胞生长素、肿瘤坏死因子、人心钠素、表皮生长因子等。人胰岛素由A、B二条链组成，A是21个氨基酸，B链是30个氨基酸，由2个2S键相连。3、基因工程在抗生素生产菌种改造方面的应用解除限速步骤，提高抗生素产量 在抗生素合成中，某些步骤对整个生物合成至关重要，对这些关键步骤酶（限速酶）的改造，可以提高抗生素的产量，如十一烷基灵红菌素和秦乐菌素生物合成的最后阶段的酶是限速酶，该过程是由一个甲基转移酶控制的，将该酶基因克隆后，经过适当改造，再转入原菌株阻断突变株中，使
15、得该酶活性大幅度提高，最终使抗生素的合成能力提高了近10倍。阻断支路代谢，增加有效组份含量 阿维菌素B组分向A组分的转化是由aveD 基因编码的C5-O-甲基化酶催化的。AveD引入抗性基因或调节基因，提高抗生素产量 大多数抗生素产生菌都具有对自身产生的抗生素的耐受能力，而抗生素的产量一定程度上取决于对自身产生的抗生素的耐受能力的大小，利用多烤贝质粒，克隆这些抗性基因，再转入到产生菌中，从而提高抗生素产生能力。如克隆氨基糖苷-乙酰转移酶基因，再转入卡那霉素和新霉素产生菌中，结果使菌种自身对氨基糖苷类抗生素的抗性增加，使卡那霉素和新霉素的产量提高了26倍。引入血红蛋白基因，提高抗生素产量 在抗生
16、素发酵过程中，供氧往往是一个限制因素，且大量消耗能源。在解决供氧方面也有不少成功的报道，美国科学家将与氧传递有关的透明颤菌的血红蛋白基因，克隆到天蓝色链霉菌中，可使在通气不足时放线紫红素的产量提高4倍。将血红蛋白基因克隆倒头孢菌素C产生菌后，该菌在发酵过程中氧耗明显下降，且有效增加了头孢菌素C的产量。三、菌种退化（一）、退化的原因（二）、防止退化的措施菌种退化：菌种的一个或多个特性，随时间的推移逐步减退或消失的现象，一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物产量的下降。（一）、退化的原因 1、菌系不纯 2、异核现象 3、自然分化现象 4、回复突变 5、培养条件或保藏方法不利 6、其它（一）、
17、防止退化的措施 1、多做平行菌种，少转接传代 2、认真进行单菌落分离 3、选择有利于高产菌，不利于低产菌的培养条件 4、良好的保藏方法四、菌种保藏（一）、菌种保藏的原理（二）、常用菌种保藏的方法（三）、国内外重要的菌种保藏机构（一）、菌种保藏的原理 1、控制培养基营养成份在最低水平 2、缺氧 3、干燥 4、低温（二）、常用菌种保藏方法 1、斜面冰箱保藏法 2、砂土管保藏法 3、覆盖惰性液体保藏法 4、真空冷冻干燥保藏法 5、30低温保藏法 6、液氮超低温保藏法（三）、国内外重要菌种保藏机构 1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国
18、冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪）6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所 8、中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院微生物研究所（真菌、细菌），北京 中国科学院武汉病毒研究所（病毒），武汉 9、中国典型微生物菌种保藏管理中心 武汉大学，武汉 10、中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院，北京 11、中国医学微生物菌种保藏管理中心 中国医学科学院皮肤病研究所（真菌），南京 卫生部药品生物制品检定所（细菌），北京 中国医学科学院病毒研究所（病毒），北京 12、工业微生物菌种保藏管理中心 轻工业部食品发
19、酵工业科学研究所，北京一、自然界中细菌的分离一、自然界中细菌的分离第三节第三节 几种微生物培养分离几种微生物培养分离(一一)采样和采集方法采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。采样的注意事项采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群
20、的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长1 1土样采集方法土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2 2
21、植物体采集方法植物体采集方法 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。3 3水样采集方法水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水
22、中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。土中细菌的富集培养与分离 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。富集方法富集方法运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适
23、度稀释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过0.22m无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术水中细菌分离的简易富集技术 在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤次代
24、培养及纯化步骤 1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。二、放线菌的分离二、放线菌的分离(一)采样及采集方法应尽可能实行无菌操作。所采集的样本应具有一定的代表性。样本采集完后，应及时处理或在4下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。放线菌的分离放线菌的分离 (实验已经进行实验已经进
25、行)土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。次代培养及纯化次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分
26、离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。三三、真菌分离1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基
27、可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法,组织分离。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。四、生产选种四、生产选种 是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH