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1、第第5章章 荧光分析法与荧光分析法与化学发光分析法化学发光分析法5.1 5.1 荧光分析法荧光分析法5.2 5.2 化学发光分析法化学发光分析法基本内容基本内容1相关定义光致发光：分子、原子吸收光辐射时被激发，然后再发射出与吸收的波长相同或更长光的现象。荧光：物质分子吸收光子能量被激发后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光。分子荧光分析法：研究物质分子的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法，简称荧光分析法。化学发光：基于化学反应产生能量来激发分子，分子由激发态回到基态时产生的光辐射现象。2特点荧光分析法：灵敏度高、选择性好荧光分析法：灵敏度高、选择性好 化学发光分析法：灵
2、敏度高；线性范围宽；分析化学发光分析法：灵敏度高；线性范围宽；分析速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器等；没有散射光及杂散光等引起的背景值。等；没有散射光及杂散光等引起的背景值。35.1 荧光分析法荧光分析法5.1.1 基本原理基本原理 5.1.2 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 5.1.3 荧光分光光度计荧光分光光度计5.1.4 分析方法分析方法5.1.5 应用示例应用示例45.1.1 基本原理1分子中电子的激发过程分子中电子的激发过程2分子荧光的产生分子荧光的产生3荧光光谱的类型和特征荧光光谱的类型和特征51分子中电子的激发过程分子中电子的
3、激发过程62.分子荧光的产生分子荧光的产生振动弛豫振动弛豫 内部能量转换内部能量转换 荧光发射荧光发射 外部能量转换外部能量转换 体系间跨越体系间跨越 磷光发射磷光发射 73荧光光谱的类型和特征荧光光谱的类型和特征1）激发光谱和发射光谱）激发光谱和发射光谱2）荧光光谱特征）荧光光谱特征81）激发光谱和发射光谱）激发光谱和发射光谱激发、荧光图形激发光谱变不变Fex图发射光谱不变变Fem图9硫酸奎宁的激发光谱（硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（及荧光光谱（b）102）荧光光谱特征）荧光光谱特征（1）Stokes位移位移（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关）荧光发射光谱的形状与激发波长无关（3）
4、荧光光谱与激发光谱的镜像关系）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 11蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 12蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁13与与UV比较比较u相同点 区段：区段：Vis-UV区区 适用性：均可用于定性定量，多用于定量适用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似定量方法：相似样品性质、量：以液体为主、均少样品性质、量：以液体为主、均少分析时间：均快分析时间：均快操作难易程度：易操作难易程度：易14与与UV比较比较u不同点 UV FL性性 质质 分子吸收光谱分子吸收光谱 分子荧光光谱分子荧光光谱 应用范围应用范围 广广 有荧光的物质，较少有荧光的物质，较少 选择性选择性
5、不高不高 高高灵敏度灵敏度 g/ml10-7 10-1010-12仪器观察角度仪器观察角度 透射光透射光 90 谱线数目谱线数目 12155.1.2 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 1荧光效率与荧光产生的条件荧光效率与荧光产生的条件2影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素3影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素16(1)荧光效率荧光效率激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用光的光子数之比，常用f表示：表示：f (01)f 大的有荧光发射大的有荧光发射17（2）产生荧光的必备条件）产生荧光的必备条件强紫外强紫
6、外-可见吸收可见吸收一定的荧光效率一定的荧光效率*跃迁跃迁 强吸收带强吸收带 n*跃迁跃迁 弱吸收带弱吸收带存在共轭的存在共轭的*跃迁，跃迁，f高，荧光强度大。高，荧光强度大。182影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素(1)共轭效应共轭效应(2)分子的刚性与共平面性分子的刚性与共平面性(3)取代基效应取代基效应19(1)共轭效应共轭效应绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的*跃迁。跃迁。电子共轭程度越大，荧光强度电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
7、（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。20 苯 萘 蒽 ex 205nm 268nm 356nm em 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.3621(2)分子的刚性与共平面性分子的刚性与共平面性 在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光率越大，并且荧光波平面性越大，荧光率越大，并且荧光波长产生长移。长产生长移。22(3)取代基效应取代基效应第一类取代基：第一类取代基：NH2、OH、OCH3、NHR、NR2、CN等等第二类取代基：第二类取代基：COOH、NO2、CO、NO、SH、NHCOCH3、F、Cl、Br、I等等第三类
8、取代基：第三类取代基：R、SO3H、NH3等等233影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素温度温度溶剂溶剂pH值的影响值的影响荧光熄灭剂的影响荧光熄灭剂的影响 散射光的干扰散射光的干扰 24温度和溶剂温度和溶剂温度温度：温度升高，荧光物质的荧光效率温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度下降和荧光强度下降溶剂溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而溶剂极性增大，荧光波长随着而长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小，长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小，荧光强度减小荧光强度减小25pH值的影响值的影响当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影
9、响，值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度有差异。间的平衡改变，因此荧光强度有差异。26苯胺在不同苯胺在不同pH值下有下列平衡关系值下有下列平衡关系 苯胺在苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在蓝色荧光。但在pH13的溶液中均以苯胺离的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。子形式存
10、在，故不能发射荧光。27荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。28常见的荧光熄灭剂常见的荧光熄灭剂卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物氮化合物、羰基化合物、羧基化合物荧光熄灭的形式：荧光熄灭的形式：a、碰撞、碰撞、b、生成不发光配位化合物、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化荧光物质氧化29散射光的影响散射光的
11、影响瑞利散射光瑞利散射光拉曼散射光拉曼散射光干扰荧光测定，应采取措施消除干扰荧光测定，应采取措施消除30硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱315.1.3 荧光分光光度计321.激发光源激发光源高压氙灯高压氙灯 强谱线的连续光谱强谱线的连续光谱 连续分布在连续分布在250-700nm250-700nm波长范围内，尤其是波长范围内，尤其是300-400nm300-400nm波长波长之间的谱线强度几乎相等之间的谱线强度几乎相等汞灯汞灯 线光谱线光谱高压：近紫外区高压：近紫外区365nm,398nm365nm,398nm，405nm405nm，436nm4
12、36nm，546nm546nm，579nm579nm低压低压:紫外区，最强紫外区，最强254nm254nm332.单色器单色器激发单色器激发单色器-除去不需要的光线除去不需要的光线发射单色器发射单色器-选择不同的荧光发射波长选择不同的荧光发射波长343.样品池样品池低荧光的玻璃或石英低荧光的玻璃或石英方形适用于方形适用于90测量测量354.4.检测器检测器光电倍增管光电倍增管365.读出系统读出系统数字电压表数字电压表记录仪记录仪带有计算机控制的读数装置带有计算机控制的读数装置 375.1.4 分析方法 溶液产生荧光的光路示意图溶液产生荧光的光路示意图 381荧光强度与物质浓度的关系荧光强度与
13、物质浓度的关系 F=KfI0（1-e-bC）K仪器常数，仪器常数，f激发光强度激发光强度当当C很小时很小时，A=bC0.05时时，e-bc=1-bcF=kfI0bC=KC392定量分析方法定量分析方法 标准曲线法标准曲线法比例法比例法多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析403荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介（1）激光荧光分析）激光荧光分析（2）时间分辨荧光分析）时间分辨荧光分析（3）同步荧光分析）同步荧光分析 415.1.5 应用示例1无机离子的测定无机离子的测定与有机试剂形成配合物后进行荧光分析，测定方法常用直接荧与有机试剂形成配合物后进行荧光分析，测定方法常用直接荧光法或荧光熄
14、灭法。光法或荧光熄灭法。2有机化合物的测定有机化合物的测定具有高度共轭体系的脂肪族化合物（如维生素具有高度共轭体系的脂肪族化合物（如维生素A、胡萝卜素等）、胡萝卜素等）和芳香族化合物和芳香族化合物 药物中的胺类、甾体类、抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质、药物中的胺类、甾体类、抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质、酶酶 425.2 化学发光分析法5.2.1 基本原理基本原理5.2.2 发光反应主要类型发光反应主要类型5.2.3 化学发光的测量仪器化学发光的测量仪器5.2.4 分析方法分析方法5.2.5 应用与示例应用与示例435.2.1 基本原理化学发光是基于化学反应提供的足够能量，化学发光是基于化学反
15、应提供的足够能量，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，形成激发态分子，当它们从激发态跃回基形成激发态分子，当它们从激发态跃回基态时，就发出一定波长的光。态时，就发出一定波长的光。44化学发光的反应式化学发光的反应式反应式表示为：反应式表示为：A+B C*+D C*C+hv 其中，其中，C*是产物是产物C的激发态（下同）。的激发态（下同）。45化学发光反应的基本条件化学发光反应的基本条件 化学发光包括吸收化学能和发光两个过程，要产生化学发光包括吸收化学能和发光两个过程，要产生化学发光现象，必须满足以下条件：化学发光现象，必须满足以下条件：（1）化学发光反应
16、必须提供足够的化学激发能，以引起电子）化学发光反应必须提供足够的化学激发能，以引起电子激发。激发。（2）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。的形式消耗能量。（3）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。的形式消耗能量。46化学发光效率化学发光效率 475.2.2 发光反应主要类型1气相化学发光气相化学发光 2火焰化学发光火焰化学发光 3液相化学发光液相化学发光 481气相化学发光气相化学发光（1）臭氧的反应）臭氧的反应 臭氧可与臭氧可与40余种
17、有机化合物余种有机化合物产生化学发光反应产生化学发光反应（2）氮氧化合物的反应）氮氧化合物的反应 一氧化氮与臭氧的气一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较大的化学发光效率相化学发光反应有较大的化学发光效率（3）氧原子的反应）氧原子的反应 气相中的气相中的SO2、NO、NO2及及CO等能与氧原子产生化学发光反应等能与氧原子产生化学发光反应 492火焰化学发光火焰化学发光火焰化学发光是在火焰化学发光是在300400的火焰中，热辐射的火焰中，热辐射是很小的，某些物质可以从火焰的化学反应中是很小的，某些物质可以从火焰的化学反应中吸收化学能而被激发，从而产生火焰化学发光。吸收化学能而被激发，从而产生火焰化
18、学发光。火焰化学发光现象多用于硫、磷、氮和卤素的火焰化学发光现象多用于硫、磷、氮和卤素的测定。测定。50火焰化学发光的类型火焰化学发光的类型（1）一氧化氮的反应）一氧化氮的反应 一氧化氮在富氢火焰中一氧化氮在富氢火焰中燃烧时产生很强的火焰化学发光反应，二氧化氮燃烧时产生很强的火焰化学发光反应，二氧化氮在富氢火焰中能迅速地被氢原子还原为一氧化氮，在富氢火焰中能迅速地被氢原子还原为一氧化氮，因而此法可用于测定空气中因而此法可用于测定空气中NOx的总量。的总量。（2）挥发性硫化物的反应）挥发性硫化物的反应 当挥发性硫化物如当挥发性硫化物如SO2、H2S、CH3SH及及CH3SCH3等在富氢火焰中等在
19、富氢火焰中燃烧时，产生很强的蓝色化学发光。燃烧时，产生很强的蓝色化学发光。513液相化学发光液相化学发光 常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米诺是没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米诺是最常用的发光试剂最常用的发光试剂。525.2.3 化学发光的测量仪器1分立取样式分立取样式2流动注射式流动注射式53流动注射式化学发光仪示意图R-试剂载流；S-试液；P-蠕动泵；V-进样阀；D-化学发光检测器545.2.4 分析方法化学发光分析主要用于定量分析。化学发光分析主要用于定量分析。1化学发光强度与反应物浓度的关系化学发光强度与反应
20、物浓度的关系552常用发光试剂常用发光试剂（1）鲁米诺类）鲁米诺类（2）光泽精类）光泽精类（3）钌）钌()-联吡啶配合物联吡啶配合物（4）其它化学发光试剂）其它化学发光试剂 565.2.5 应用与示例 1无机化合物的分析无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无机可以利用某些具有还原性的无机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对化阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测定学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某些此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某些离子。离子。2有机化合物的分析有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接被可以利用物质的还原性，直接被氧化剂氧化发光测定。氧化剂氧化发光测定。57