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1、第 28卷 第 3期2 0 1 0年 3月中 华 中 医 药 学 刊CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONAL CHINESE M ED I CINEVo.l 28 No.3M ar.2 0 1 0中华中医药479学刊四角蛤蜊多糖的提取工艺与单糖组分研究金燕,吴皓,常念,栾合密,王令充(南京中医药大学新药与海洋药物研究开发中心,江苏 南京 210029)摘 要:目的:从四角蛤蜊软体中提取多糖物质,并初步研究多糖提取物的组成和性质。方法:四角蛤蜊软体经水提醇沉后得粗提物,粗提物过 732阳离子树脂柱后得四角蛤蜊多糖提取物。FT I R 分析多糖提取物的成分,蒽酮硫酸法测定多
2、糖含量,TLC法鉴定粗提物和多糖提取物的单糖组成。结果:从四角蛤蜊软体中提取得到四角蛤蜊多糖,总糖含量达 99%以上,蛋白含量小于 1%,单糖组成主要由葡萄糖构成。结论:四角蛤蜊软体经水提醇沉、732阳离子树脂柱后可得四角蛤蜊多糖,其单糖组成主要为葡萄糖。关键词:四角蛤蜊;多糖;提取;单糖组成中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)03-0479-03Isolati on of polysaccharide fromMactra Veneriform isJI N Yan,WU Hao,CHANG N ian,LUAN He-m,i WANG L in
3、g-chong(Nanjing University of ChineseM edicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China)Abstract:O bjective:To isolate the polysaccharide(MVPS)fromMactra Venerifor mis and characterize the products.M ethods:A routine methods of water-extraction combined with alcohol-precipitation was used to receive the crudema
4、cro molecules extracts fro mM actra Venerifor m is.The crude extractswas refined by 732 cationic exchange resins andpolysaccharide componentswere collected.The polysaccharide products were analyzed by FT I R and itsmonosaccharideco mpositionwere identified by thin layer chro matography(TLC).The tota
5、lsugar contentwasdeter m ined by anthrone-su-lphuric acidmethod.Results:Total sugar content ofMVPS ismore than 99%and the protein content ofMVPS is less than1%.The TLC result shows glucose may be themonosaccharide co mposition ofMVPS.Conclusion:The polysaccharide ex-tracts can be well got by the met
6、hod used in this paper.The monosaccharide co mposition ofMVPS is glucanmainly.Keywords:M actra Venerifor m is;polysaccharide;isolation;monosaccharide component收稿日期:2009-10-17基金项目:国家海洋公益性行业科研专项基金项目(200705009);国家自然科学基金资助项目(30900293)作者简介:金燕(1982-),女,江苏昆山人,硕士研究生,研究方向:中药海洋药物。通讯作者:吴皓(1957-),女,江苏人,教授,博士研究生
7、导师。四角蛤蜊是一种广泛分布于我国南北各海区的海洋经济贝类。宋代5嘉祐本草6中记载蛤蜊肉/润五脏,止消渴,开胃,解酒毒。主老癖能为寒热者,及妇人血块,宜煮食之0。多糖物质是海洋贝类的主要活性物质,具有抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病、抗氧化、免疫调节等多种药用功能 1。现代研究证明四角蛤蜊提取物多糖具有降血糖功效 2。本文对四角蛤蜊活性成分多糖进行了提取分离研究。1实验仪器与材料1.1实验材料 四角蛤蜊软体(江苏省海洋水产研究所提供批号:200711);732阳离子树脂(国药集团化学试剂有限公司,批号:20080918),蒽酮(中国医药集团上海化学试剂公司,批号:20010306);A萘酚(国药集
8、团化学试剂有限公司,批号:T20050930);葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司,批号:F20080215);考马斯亮蓝 G-250(BIO MOL分装,批号 0411S05);牛血清白蛋白(Am resco公司,批号0628S04);其余试剂为国产分析纯。1.2实验仪器 TU-1800S紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);FA1104型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);组织绞碎机(广东南海德丰电热设备厂);725BASI C高速匀浆机(I KA公司);电热恒温干燥箱 202型(上海索谱仪器有限公司);HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);薄膜旋转蒸发仪(BUCH
9、 IRotavapor R114);80-2B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造)。2实验方法2.1四角蛤蜊粗多糖提取物的制备四角蛤蜊软体解冻沥干,粉碎,加水煎煮;提取液过滤,滤液用减压薄膜旋转浓缩,浓缩液离心后加 95%乙醇至醇浓度达到 80%,冷藏静置12h,抽滤,沉淀置真空干燥箱干燥后即得粗多糖提取物。2.2 四角蛤蜊粗多糖提取物提取条件优化 在四角蛤蜊粗多糖提取物的提取过程中,水煎煮是影响多糖提取的主要步骤。以提取液中糖含量为考察指标,考察水煎煮过程479第 28卷 第 3期2 0 1 0年 3月中 华 中 医 药 学 刊CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONA
10、L CHINESE M ED I CINEVo.l 28 No.3M ar.2 0 1 0中华中医药480学刊中软体粉碎程度、提取时间、煎煮时间和加水量,按照 L9(34)正交试验表设计实验。表 1 因素水平表水平因 素绞碎程度(A)煎煮时间(B)每次煎煮加水量(C)煎煮次数(D)1整个30m in2倍1次20.5cm绞碎60m in3倍2次3匀浆90m in4倍3次表 2不同提取条件对糖提取率的影响序号绞碎程度A时间B加水量C次数D总糖提取率(%)111112.64212223.20313333.87421234.17522313.19623123.85731323.99832134.259
11、33213.54K19.7010.8010.749.36K211.2110.6410.9111.04K311.7811.2611.0512.29R2.080.620.312.942.3 四角蛤蜊粗多糖提取物中多糖的精制 3 称取 3g粗多糖提取物,用 50mL蒸馏水溶解,过 732阳离子树脂柱,用蒸馏水洗脱,收集洗脱液。以 M olish试剂检测糖组份,洗出液未检出多糖时停止收集。用 0.5mol#L-1NaOH溶液调节洗脱液 pH至 7.0,减压薄膜旋转浓缩,乙醇沉淀,冷藏静置 12h。滤过,干燥,即得精制后的四角蛤蜊多糖。用硫酸蒽酮法测四角蛤蜊多糖中糖含量 4,用考马斯亮蓝法测定四角蛤蜊多
12、糖中蛋白含量 5。采用压片法,将样品与溴化钾按 1B100比例混合、压片,测定红外吸收光谱。2.4 TLC法鉴定四角蛤蜊粗多糖和精多糖的单糖组成 精密称取四角蛤蜊粗提物和精多糖各 20mg,装入 10mL安瓿中,加 1mol#L-1的硫酸 5mL,封口,沸水浴水解 8h,以碳酸钡中和硫酸,14000r#m in-1离心 10min,上清液定容至5mL容量瓶中,即得供试品溶液。对照品溶液用蒸馏水配5mg#kg-1的单糖对照品溶液于 5mL容量瓶中。将硅胶板在 105e 下活化 1h,用玻璃点样毛细管分别将各单糖标准品溶液(5mg#mL-1)和四角蛤蜊粗多糖和精多糖全水解液点样于硅胶板上,吹干,以
13、 n-BuOHB M e2COB H2O=4B5B1(V/V)为展开体系上行展开,显色时,将 DAP试剂(二苯胺-苯胺-磷酸)喷洒与薄层板上,于 100e 烘烤约 10 m in即显色 6-7。3实验结果3.1 四角蛤蜊醇沉粗多糖提取物提取条件优化结果根据结果:各因素对实验结果的影响为 A、D有显著性差异(P A B C,故直观分析四角蛤蜊软体最佳提取工艺为 A3B3C3D3,即取四角蛤蜊软体,解冻沥干后匀浆,煎煮 3次,每次加软体重量 4倍量的水,每次 90min。表 3方差分析表方差来源平方和自由度均方F显著性A0.768920.384448.2*B0.068320.03414.3C(误差
14、)0.016020.00801.0D1.446420.723290.7*注:F1-0.05(2,2)=19.00,F1-0.01(2,2)=99.00,*P 0.05;*P 0.01。3.2 四角蛤蜊粗多糖提取物中多糖精制结果 经过 732阳离子树脂去蛋白后获得的四角蛤蜊精多糖为白色无定形粉末,略有晶体光泽。用硫酸蒽酮法测得四角蛤蜊多糖中总糖含量为 104%,多糖含量为 93%。用考马斯亮法测得四角蛤蜊多糖中蛋白含量为 0.2%。四角蛤蜊多糖红外吸收光谱图见图 1。图 1 精多糖红外吸收光谱图在 3400c m-1附近出现一个宽峰,是形成了氢键的-OH伸缩振动吸收峰;在 2938c m-1附近
15、有一个中等吸收的-CH 伸缩振动峰(亚甲基所产生),可认为是糖类的特征吸收;1485 1350cm-1之间出现的多峰为-CH 弯曲振动吸收峰(O-CH2所产生);1200 1020cm-1之间出现强峰是环上缩酮或缩醛 C-O 伸缩振动吸收峰,为糖类的特征吸收之一;930cm-1附近吸收峰是 O-CH2的 C-O伸缩振动吸收峰,也是糖类的特征峰之一 8-10。3.3 TLC法鉴定四角蛤蜊粗多糖和精多糖的单糖组成 见图 2。样品编号:1.D-阿拉伯糖 2.D-氨基半乳糖 3.D-半乳糖4.D-葡萄糖 5.四角蛤蜊粗多糖水解液 6.四角蛤蜊精多糖水解液 7.D-氨基葡萄糖 8.D-核糖 9.D-甘露
16、糖 10.D-木糖 11.L-鼠李糖图 2四角蛤蜊粗多糖和精多糖水解液及标准单糖对照品的薄层层析图480收稿日期:2009-10-12基金项目:国家自然科学基金资助项目(30701085);北京市属市管高等学校人才强教计划资助项目(BAHED2006)作者简介:徐鹏(1985-),男,湖北武汉人,硕士研究生,研究方向:中药材质量调控研究。通讯作者:刘长利(1976-),男,河北承德人,讲师,博士,研究方向:中药材规范化生产及其药材质量调控研究。T e:l010-83911633,E-mai:l lcl74 。薄层层析结果显示,四角蛤蜊粗多糖和精多糖水解液均呈单一棕色斑点,且其 Rf值与葡萄糖标
17、准品一致。4讨 论多糖具有调控细胞分裂和分化,免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等药理作用,多糖的结构、构象等与其生理功能有密切关系。目前多糖提取方法主要有机溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法,不同提取分离技术会造成多糖结构及活性的差异 11-12。本实验优化水提法提取工艺并通过 732阳离子树脂柱制得总糖含量达到 99%以上的四角蛤蜊多糖,该多糖为白色无定形粉末,略有晶体光泽。四角蛤蜊精多糖红外光谱特征显示其具有多糖的系列特征峰;薄层层析结果推测四角蛤蜊多糖可能是由葡萄糖组成,其具体组成结构有待进一步分析。参考文献 1 刘莺,刘新,牛筛龙.海洋生物活性
18、多糖的研究进展 J.医药导报,2006,25(10):1044-1046.2 吴皓,王令充,狄留庆,等.四角蛤蜊提取物及其制备方法和应用 P.中国专利,200910027802.0.3 张莉,吴皓.阳离子交换树脂法除珠蚌蛋白质的工艺研究 J.南京中医药大学学报,2004,20(3):173-174.4 吴永霞,吴皓,狄留庆,等.两种淡水育珠蚌中多糖的含量测定 J.南京中医药大学学报,2006,22(2):99-100.5 李建武.生物化学实验原理和方法 M.北京:北京大学出版社,1994:160-176,401,406.6 张劲游,蔡顺养.糖类薄层层析的一个优良系统 J.中国抗生素杂志,198
19、6,1(3):226-227.7 焦广玲,于广利,赵峡.几种寡糖和单糖在不同展开体系中的薄层色谱行为 J.中国生化药物杂志,2007,28(6):273-473.8 张正行.有机光谱分析 M.北京:人民卫生出版社,1995:39-103.9 夏朝红,戴奇,房韦,等.几种多糖的红外光谱研究 J.武汉理工大学学报,2007,29(1):54-74.10 张剑韵,包立军,梁进,等.桑叶多糖的分离及红外光谱和气相色谱分析 J.蚕业科学,2007,33(4):155-255.11 方崇波.海地瓜中多糖的提取和药理作用研究 J.时珍国医国药,2003,14(2):76-77.12 张锦雀,黄丽英,苏聪枚.
20、中草药多糖提取分离纯化研究进展 J.中草药,2008,31(11):1760-1764.第 28卷 第 3期2 0 1 0年 3月中 华 中 医 药 学 刊CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONAL CHINESE M ED I CINEVo.l 28 No.3M ar.2 0 1 0中华中医药481学刊高效液相色谱法测定甘草植物体内脱落酸含量的研究徐鹏,刘长利,许利平,于萍(首都医科大学中医药学院,北京 100069)摘 要:目的:建立甘草植物抗旱信号传导物质脱落酸的含量测定方法,为揭示甘草抗旱性与有效成分积累相关机制奠定理论依据。方法:甘草须根中的脱落酸用 80%的甲
21、醇抽提,抽提液经过盐酸酸化、乙酸乙酯萃取最终得到供试品溶液,应用 W aters-C18色谱柱(4.6mm 250mm,5Lm),以乙腈-0.1%磷酸水为流动相,进行二元梯度洗脱;流速:0.6mL#m in-1,紫外检测波长为 260nm,柱温:25 e。结果:脱落酸在 0.0336 0.672Lg线性关系良好(r=0.9999),甘草样品平均回收率 90.35%,RSD 为 1.70%,甘草须根中的 ABA 含量 为 0.0770.188mg#g-1。结论:该法灵敏度高、专一性强、重复性好,为进一步开展甘草抗旱性与有效成分积累相关机制的研究提供依据。关键词:甘草;脱落酸;HPLC;含量测定中
22、图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)03-0481-03Deter m ination of Abscisic acid in Fibrous root ofG lycyrrhiza uralensis Fisch.by HPLCXU Peng,LI U Chang-l,i XU L-i ping,YU Ping(CapitalM edicalUniversity School ofT raditionalChineseM edicine,Beijing 100069,China)Abstract:Objective:To establish anHPLC method for deter m ination the content of abscisic acid(ABA)in fibrousroot ofG lycyrrhiza uralensisF isch.M ethods:The phytohor mone in glycyrrhizae fibrous rootwas extractedwithmethanol)481