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1、一.定义定义紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法:是通过测定被测物质在紫外可见光区的特定波长处或一定波长范围内的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法一般是在200760nm波长范围内选择。二.原理原理 1.透光率或透光度T：透过光的强度为t与入射光的强度为0之比称透光率或透光度，用表示，即：Tt/0*100 2.吸光度A:透光率的倒数反映了溶液对光的吸收强度，其定义为：AlgT；T=10-a。3.实践证明，溶液对光的吸收程度，与该溶液的浓度、溶液液层的厚度及入射光的波长等因素有关。当入射光的波长保持不变，则溶液对光的吸收程度与溶液的浓度和溶液液层的厚度
2、有关。朗伯和比尔分别于1760年和1852年研究了光的吸收与溶液的浓度和溶液液层的厚度的定量关系。即：朗伯比尔（LamLert-Beer）定律：当一束平行的单色光通过浓度一定的某一含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液的温度等保持不变的条件下，该溶液的吸光度A与溶液液层的厚度L成正比。A=ECL 或 C=A/EL 其中：A为吸光度；C为溶液浓度；E为常数，称为吸收系数；L为光通过溶液的长度，单位为cm；吸光系数E在一定的条件下是一个常数，它与入射光的波长、物质的性质及溶液的温度等有关。吸光系数是物质的特性常数之一，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。当溶液的浓度为1（C=1），光通
3、过溶液的长度为1cm时，E=A,称为百分吸收系数（E1%1cm）,表示为 E1%1cm A/C L。三.应用1 定性1.1鉴别方法：物质的定性就是对物质作鉴定，用紫外可见吸收光谱对物质进行鉴定时，主要根据光谱上的一些特征吸收，包括最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比值等。（1）对比吸收光谱图的一致性(将试样与其标准品配成相同浓度的溶液)（2）对比吸收光谱特征数据的一致性（最大吸收波长和吸收系数）（3）对比吸收度（或吸光系数）的比值的一致性a.吸收峰:曲线上吸收最大值且比左右相邻都高之处称为吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长b.谷:峰与峰之间且比左右相邻都低之处称为谷，它所对
4、应的波长称为最小吸收波长c.肩峰:在吸收峰旁形状像肩的小曲折处叫尖峰d.末端吸收:吸收光谱曲线波长最短的一端，呈现强吸收，吸收度相对大但不成峰形的部分1.2杂质检查：利用不同化合物的紫外光吸收不同（具有特征吸收波长）进行杂质检查。1.纯度检查 2.杂质限度检查（有时可利用峰谷吸光度比值控制杂质贤亮）2.定量 2.1单组分的定量方法(1)标准曲线法 测定时,先配制一系列浓度不同的标准溶液,在同一条件下分别测定吸光度,考查浓度与吸光度成直线关系的范围,然后以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制A-c关系曲线，或叫工作曲线。如符合比尔定律，将得到一条通过原点的直线。也可用直线回归的方法，求出回归的直线
5、方程。再根据样品溶液所测得吸光度，从标准曲线或或回归方程求得样品溶液的浓度。(2)对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的10010%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算含量，即得。计算式 A样W对/稀释倍数1001 含量（%）=-100%A对W样/稀释倍数1001(3)吸光系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。计算式 A样 含量（%）=-100%W样/稀
6、释倍数(E)对10012.2多组分的定量方法(1)解线性方程法(2)等吸收双波长消去法3.药典中多用于制剂的含量测定。（1）对照品比较法 根据 A样=E样C样L样 A对=E对C对L对 其中 E样E对 L样L对 A样 C样 得出 C样C对A样A对 A对 C对 W对 N对A样样品的百分含量原料药为：100 W样N样 A对 W对 N对A样W平均片剂、胶囊剂或颗粒剂等为：100 W样N样A对规格 W对 N对A样注射液为：100 V样N样A对规格N为稀释度，规格表示每片（或粒或袋或支）含主药的克数（见P243-245例1、例2，注意：注意：求校正因子f时保留五位有效数字）（2）吸收系数法（前提条件:已知
7、吸收系数E1%1cm，通常大于100，并保证分光光度计性能优良，应选择在最大吸收度狭缝处测定）（见P246-249例1、例2、例3）根据 A样=E样C样L样 L样1 A样样品的百分含量原料药为：100 E1%1cm1100W样N样 A样W平均片剂、胶囊剂或颗粒剂等为：100 E1%1cm1100W样N样规格 A样注射液为：100 E1%1cm1100V样N样规格例1：维生素B12注射液含量测定 精密量取本品适量，加水制成每ml约含维生素B12 25g的溶液，照紫外可见分光光度法在361nm波长处测定吸收度，按维生素B12吸收系数（E1%1cm）为207计算即得。（规格为1ml：1mg）具体操作
8、：精密量取本品5ml，置250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，以水为空白，在361nm波长处测定吸收度为0.409。A样百分含量 100 E1%1cm1100V样N样规格 0.409 10098.8。207110051/2500.001例2：氯氮卓片含量测定 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于氯氮卓30mg），置100ml量瓶中，加盐酸溶液（91000）70ml，充分振摇使氯氮卓溶解，用盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml，置另一100ml量瓶中，用盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀，照紫外可见分光光度法，在308nm的波长处测定吸收
9、度，按氯氮卓吸收系数（E1%1cm）为319计算，即得。（规格为10mg）具体操作：取本品20片，称定：1.7320g，研细，精密称取0.2546g，按上述方法操作，测定吸收度为0.460。具体操作：取本品20片，称定：1.7320g，研细，精密称取0.2546g，按上述方法操作，测定吸收度为0.460。A样W平均百分含量 100 E1%1cm1100W样N样规格 0.4601.732020 10098.1。31911000.25461/1005/1000.01(3)计算分光光度法(对仪器要求较高，多采用双波长法)(4)比色法四紫外可见分光光度计 紫外-可见分光光度计其应用波长范围为20040
10、0nm的紫外光区、400760nm的可见光区。主要由光源、单色器、吸收池、检测器、指示器等主要部件组成。（一）主要部件 1.光源：是提供入射光的装置，分光光度计对光源的要求是能发射强度足够而且稳定的连续光谱。常用光源有：钨灯（可见光），氘灯（紫外光）。2.单色器：其作用是将来自光源的复合光，按波长顺序色散分离出所需波长的单色光。常用的色散元件是棱镜或光栅，由棱镜或光栅和狭缝组成。3.吸收池：也叫比色皿或比色杯，在分光光度法分析中，用来盛放样品溶液的器皿。用光学玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区；用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，适用于紫外光区，也可用于可见光区，吸收池必须匹配，厚度应一致，盛同一
11、溶液，在所用波长处测吸光度，两者误差应在0.2-0.5%之内。4.检测器：是测量光线透过溶液以后强弱变化的装置，其作用是检测光信号，并将光信号转换成电信号，一般采用光电管或光电倍增管。使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。（二）分光光度计的光学性能 1.波长的准确度试验 可用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正或用氧化钬玻璃检定。2.吸光度准确度 用重铬酸钾硫酸溶液检定，测定吸收度，在换算成E1%1cm，允差范围为1。3.杂散光 通常以光强较弱的波长处（如220nm，340nm处），所含杂散光的强度百分比作为指标，采用1碘化钠在220nm测得透过率应0.8；采用5亚
12、硝酸钠在340nm测得透过率应0.8，即符合规定。（三）注意事项1.空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。2.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池,石英吸收池必须洁净，必须配对（盛装同一溶剂，在规定波长测定吸收池透光率，应小于0.3），否则要引入测定误差。3.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.30.7之间的误差较小。4.测定前应先检查所用溶剂在测定波长附近是否符合要求，每次使用同一厂牌批号，混合均匀的溶剂。（220240nm,A应0.4；241250nm，A应0.2；251300nm,A应0.1；300nm以上，A应0.05）5.在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池34次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。6.选择狭缝宽度，CP大部分品种可采用2nm，但采用吸收系数法测定含量时，必须调节狭缝宽度，尽量小，至供试品吸收度不在增加。7.测定时应先在规定吸收波长2nm附近确定最大吸收波长，除另有规定外应在规定吸收波长2nm以内，并以此最大吸收波长作为测定波长。