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1、3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺基因工程菌：基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。细菌和酵母是重要的表达重组药物的制
2、药生物。基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统3.1.1 酵母表达系统酵母表达系统基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类细胞：G细胞：G，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。3.1.1 大肠杆菌表达系统3.1.1 大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌（1、大肠杆菌（Eschericlia coliEschericlia coli）形态特征）形态
3、特征基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。2、生化与遗传特性、生化与遗传特性基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类复制起始点选择标记多克隆位点复制起始点选择标记多克隆位点3
4、、质粒载体3、质粒载体基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类?严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；?松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。?克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。?测序质粒：用于基因测序。测序质粒：用于基因测序。?整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。?穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。穿
5、梭质粒：能在两种宿主细胞存在。?表达质粒：能表达基因产物表达质粒：能表达基因产物质粒类型质粒类型基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。4、产物表达形式、产物表达形式基因工程制药工程菌种类基因
6、工程制药工程菌种类发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70），培养周期短，抗污染能力强。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。5、优点和不足5、优点和不足基因工程制药工程菌种类基因
7、工程制药工程菌种类6、应用?大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。?多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）?激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)?细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂?溶栓酶类：rPA溶栓酶类：rPA
8、?白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。3.1.2 酵母表达系统酵母表达系统1、形态特征、形态特征基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、
9、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因2、生长与遗传特征、生长与遗传特征基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类五种类型的载体，五种类型的载体，安全、
10、无毒。安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。3、优点与不足、优点与不足基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素1981年Hitzman等：
11、酵母表达人干扰素?激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素，激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素，细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子?多肽类：高血糖素多肽类：高血糖素?2种乙肝疫苗等。2种乙肝疫苗等。?8种产品8种产品4、应用、应用基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类小结?表达系统：宿主菌+表达质粒表达系统：宿主菌+表达质粒?生物学，生产特征生物学，生产特征?大肠杆菌系统：大肠杆菌系统：?酵母系统：酵母系统：基因工程制药基因工程制药工程菌与构建工程菌与构建思考题（1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系统制药
12、的优缺点，如何选择应用？（1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系统制药的优缺点，如何选择应用？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？基因工程制药基因工程制药3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺3.2.1 构建流程构建流程3.2.2 表达载体构建表达载体构建3.2.3 工程菌构建工
13、程菌构建3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建3.2.1 工程菌构建流程目标基因克隆目标基因克隆表达载体构建表达载体构建工程菌工程菌外源基因导入与培养外源基因导入与培养遗传转化与筛选遗传转化与筛选PCR，文库，化学合成PCR，文库，化学合成酶切，连接酶切，连接基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?表达载体设计表达载体设计?目标基因的定位克隆目标基因的定位克隆?酶切反应酶切反应?连接反应连接反应?转化转化?筛选与鉴定筛选与鉴定3.2.2 表达载体构建3.2.2 表达载体构建基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?表达载体概念：表达载体概念：e
14、xpression vector expression vector 在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。?外源基因表达盒(操纵子模型)：外源基因表达盒(操纵子模型)：1、表达载体的设计1、表达载体的设计目 标 基 因目 标 基 因终止子终止子启 动子启 动子基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?PCR(Polymerase chain reaction,PCR)：PCR(Polymerase chain reaction,PCR)：聚合酶链式反应：由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA 序列进行的复制反
15、应。聚合酶链式反应：由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA 序列进行的复制反应。?本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。?发明者：Mullis，生物技术革命性象征。发明者：Mullis，生物技术革命性象征。2、目标基因PCR定位克隆2、目标基因PCR定位克隆（1）PCR技术（1）PCR技术基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建(2)退火退火(55)(4)完成一个循环完成一个循环(3)延伸延伸(72)(1)变性变性(94)（2）PCR单反应原理与过程（2）PCR单反应原理与过程基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建（3）PCR循环（3）
16、PCR循环基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?模板 DNA：目标序列,10010 000bp,pg模板 DNA：目标序列,10010 000bp,pg?引物：两条寡核苷酸，引物：两条寡核苷酸，2127 bp。2127 bp。?脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTP脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTP?DNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高温DNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高温?缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM TrisHCl,1.5 mM MgCl缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM TrisHCl,1.5 mM MgCl
17、2 2（4）PCR扩增的反应体系组成（4）PCR扩增的反应体系组成基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建（5）PCR扩增产物（5）PCR扩增产物?程序：温度，时间，循环数程序：温度，时间，循环数?电泳：目标基因片段大小，特异性。电泳：目标基因片段大小，特异性。基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?概念：概念：?在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。?酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。?反应条件：适宜温度(37)，1小时以上。反应条件：适宜温度(3
18、7)，1小时以上。?终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。?电泳检查：酶切完全性。电泳检查：酶切完全性。2、酶切反应2、酶切反应基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?概念：概念：DNA 双链上相邻的 3羟基和 5磷酸基因共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。DNA 双链上相邻的 3羟基和 5磷酸基因共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。?连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。?连接反应：16-26，数小时,或过夜。连接反应：16-2
19、6，数小时,或过夜。?终止反应：在70加热10分钟。终止反应：在70加热10分钟。3、连接反应3、连接反应基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?转化:某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象转化:某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象?转染:除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程.转染:除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程.4、转化4、转化基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建大肠杆菌转化大肠杆菌转化CaClCaCl2 2法法?感受态细胞融化：置冰上，缓慢。感受
20、态细胞融化：置冰上，缓慢。?加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。?热击：42，90秒。热击：42，90秒。?置冰上，12分钟。置冰上，12分钟。?扩增培养：加入LB培养基，37，45分钟。扩增培养：加入LB培养基，37，45分钟。?涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。?筛选培养：倒置平板，37，出现菌落。筛选培养：倒置平板，37，出现菌落。基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞转化子：导
21、入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：目标重组子：含有连接正确的重组分子（含有连接正确的重组分子（目的目的）非目标重组子：不含目的基因重组子非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞类型转化后的细胞类型5、筛选与鉴定5、筛选与鉴定基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?抗生素筛选法：抗生素筛选法：抗生素的抗性基因，氨苄青霉素。抗生素的抗性基因，氨苄青霉素。?篮白斑筛选法：篮白斑筛选法：lacZlacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。基因，重组子白色，非重组
22、子蓝色。?噬菌斑筛选法：噬菌斑筛选法：转化子被裂解形成噬菌斑，非转化子正常生长。转化子被裂解形成噬菌斑，非转化子正常生长。（1）筛选方法）筛选方法基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建（2）鉴定方法（2）鉴定方法?菌落PCR：含有目标基因菌落PCR：含有目标基因?载体大小：电泳检测载体大小：电泳检测?酶切鉴定：目标基因插入及插入方向酶切鉴定：目标基因插入及插入方向?测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建3.2.3 基因工程菌的建立3.2.3 基因工程菌的建立?过程：过程：?适宜宿主菌的转化适
23、宜宿主菌的转化?筛选鉴定，遗传稳定性等。筛选鉴定，遗传稳定性等。?目标：目标：?获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建表达筛选与产物鉴定表达筛选与产物鉴定?不同菌种的表达筛选不同菌种的表达筛选?诱导表达时间和诱导强度的筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选?产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位?胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白?表达产物结构与活性鉴定表达产物结构与活性鉴定?电泳，SDS
24、PAGE，等电点电泳电泳，SDSPAGE，等电点电泳?免疫杂交，末端测序，质谱分析免疫杂交，末端测序，质谱分析?分析与目标产物的同一性分析与目标产物的同一性基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建小结?表达载体构建：基因克隆，酶切，连接转化表达载体构建：基因克隆，酶切，连接转化?工程菌构建：表达筛选，功能确认工程菌构建：表达筛选，功能确认基因工程制药基因工程制药工程菌与构建工程菌与构建思考题（1）工程菌构建的基本过程是什么，所涉及生物技术的原理是什么？（1）工程菌构建的基本过程是什么，所涉及生物技术的原理是什么？（2）在大肠杆菌中高效表达蛋白药物要着重设计哪几个方面？（2）在大肠杆菌中高效
25、表达蛋白药物要着重设计哪几个方面？基因工程制药基因工程制药3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺3.3 基因工程菌发酵培养与控制3.3 基因工程菌发酵培养与控制3.3.1 培养基组成与控制培养基组成与控制3.3.2 培养工艺与控制培养工艺与控制3.3.3 终点控制终点控制基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制3.3.1 培养基
26、组成与控制培养基组成与控制碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐选择剂选择剂诱导物诱导物基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制1、碳源1、碳源?大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源?酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。?添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。?浓度稍高后就表现出底物抑制作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。?葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。基因工程制药发酵控制基因
27、工程制药发酵控制2、氮源2、氮源?直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。?不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。?大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。?酵母：利用氨基酸为氮源酵母：利用氨基酸为氮源基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制3、无机盐?磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子
28、形态?基因工程菌生长提供必需的矿物质。基因工程菌生长提供必需的矿物质。基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌为了保证质粒的稳定性，不丢失。根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌为了保证质粒的稳定性，不丢失。根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。4、选择剂selective agent4、选择剂selective agent基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制选择剂种类选择剂种类营养缺陷互
29、补和抗生素抗性。营养缺陷互补和抗生素抗性。工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。诱导物
30、成为产物表达必不可少的。诱导物成为产物表达必不可少的。LacLac启动子表达系统：IPTG诱导。启动子表达系统：IPTG诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。5、诱导物、诱导物基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制6、培养基组成对质粒稳定性的影响?营养较丰富的培养基，质粒稳定性高于合成培养基?限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响。?大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定。?对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性。?培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。基因工程制药发酵控制基
31、因工程制药发酵控制3.3.2 培养工艺与控制培养工艺与控制?温度温度?溶解氧溶解氧?pH基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45。大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45。酿酒酵母生长最适温度为30，最高温度为40。酿酒酵母生长最适温度为30，最高温度为40。温度对工程菌发酵的影温度对工程菌发酵的影基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制生长与生产温度不一致。生长与生产温度不一致。较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性
32、蛋白质。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。温度对工程菌发酵的影温度对工程菌发酵的影基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制两段变温发酵培养：两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。
33、温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37，生产期提高温度42。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37，生产期提高温度42。温度控制温度控制基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.57.5，细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.57.5，真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.06.0。真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.06.0。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利
34、于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。pH值对发酵的影响pH值对发酵的影响基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。pH值控pH值控基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量
35、和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力考虑溶氧对质粒稳定性的影响：调节搅拌转速和通气量工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力考虑溶氧对质粒稳定性的影响：调节搅拌转速和通气量3.溶解氧控3.溶解氧控基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制?根据目标基因产物的表达模式而定。根据目标基因产物的表达模式而定。?适宜的诱导时间：非常重要适宜的诱导时间：非常重要?诱导物的浓度及其发酵温度：诱导物的浓度及其发酵温度：影响表达量，产物存在形式影响表达量，产物存在形式?在生
36、产中应严格控制。在生产中应严格控制。3.3.3 终点控制3.3.3 终点控制基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制1、化学诱导表达、化学诱导表达?化学诱导型启动子：化学诱导型启动子：lac、taclac、tac、T7等、T7等?诱导时间：对数生长期诱导时间：对数生长期?细菌：IPTG诱导细菌：IPTG诱导?甲基营养型酵母：甲醇诱导。甲基营养型酵母：甲醇诱导。基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制2、温度诱导表达2、温度诱导表达?温度诱导型启动子：温度诱导型启动子：P PL L、P PR R启动子启动子?两段培养发酵：两段培养发酵：?诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。
37、诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制小结?培养基组成与控制培养基组成与控制?培养工艺与控制培养工艺与控制?终点控制终点控制基因工程制药基因工程制药工程菌与构建工程菌与构建思考题（1）工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？（1）工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？（2）影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？（2）影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？（3）工程菌发酵中，如何确定终点？（3）工程菌发酵中，如何确定终点？基因工程制药基因工程制药3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生
38、物表达系统3.2 基因工程菌的构建技术3.2 基因工程菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与工艺控制3.3 基因工程菌的发酵培养与工艺控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺3.4.1 干扰素概述干扰素概述3.4.2 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏基因工程假单胞杆菌的构建与保藏3.4.3 干扰素的发酵工艺过程干扰素的发酵工艺过程3.4.4 干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程3.4.1 干扰素概述 干扰素的种类干扰素的种类 干扰素的临床应用干扰素的临床应用
39、 干扰素的生产工艺路线干扰素的生产工艺路线概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺1、干扰素的种类、干扰素的种类 概念：（interferon，IFN）概念：（interferon，IFN）机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的繁殖功能：干扰病毒在细胞内的繁殖 天然干扰素分类：天然干扰素分类：?I干扰素：IFN、IFN、IFN、IFN、IFN I干扰素：IFN、IFN、IFN、IFN、IFN?II干扰素：IFNII干扰素：IFN 上市重组干扰素:2a、2b、1b、1b，上市重组干
40、扰素:2a、2b、1b、1b，研发中的重组干扰素：IFN，临床阶段研发中的重组干扰素：IFN，临床阶段概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺干扰素的理化性质干扰素的理化性质143-166aa；143-166aa；MW:17-23 ku；MW:17-23 ku；pI:5.7-8.5；pI:5.7-8.5；乙醚、氯仿敏感乙醚、氯仿敏感容易吸附介质。容易吸附介质。IFN 结构结构概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺2、重组干扰素的临床应用、重组干扰素的临床应用 广谱抗病毒活性（rhuIFN）广谱抗病毒活性（rhuIFN）?慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病
41、毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFN）直接抗肿瘤活性（rhuIFN）?毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）多发性硬化症 rhuIFN多发性硬化症 rhuIFN概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺3、干扰素生产工艺路线（、干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞血浆血浆人白细胞人白细胞人白干扰素人白干扰素分离纯化分离纯化病毒诱导病毒诱导 1
42、989年：IFN-n3/Alferon，批准上市1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性潜在的血源性病毒污染的可能性概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺3、干扰素生产工艺路线（、干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：Namalva培养Namalva培养多亚型混合干扰素多亚型混合干扰素分离纯化分离纯化病毒诱导病毒诱导 1999年：IFN-n1/Wellf
43、eron,批准用于临床。1999年：IFN-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。缺点：活性低，退出临床应用。合成干扰素合成干扰素概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺3、干扰素生产工艺路线（、干扰素生产工艺路线（3）基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺上市产品：重组人干扰素rhuIFN上市产品：重组人干扰素rhuIFN?1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；?1990，rhuIFN
44、-1b；1993，rhuIFN-1b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；?20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。发酵培养包涵体复性重组人干扰素工程菌构建3、干扰素生产工艺路线（、干扰素生产工艺路线（4）上市产品：rhuIFN-1a上市产品：rhuIFN-1a?1996，Avonex(Biogen)；
45、2002，Rebif(Serono)1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺细胞培养收集培养液分离纯化重组人干扰素工程CHO细胞系构建动物无限细胞系培养生产工艺：动物无限细胞系培养生产工艺：3、干扰素生产工艺路线（、干扰素生产工艺路线（5）宿主：腐生型假单胞杆菌（宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putidaPseudomon
46、as putida）上市产品：IFN-2b上市产品：IFN-2b/安福隆安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：工艺特点：?发酵周期短：几个小时发酵周期短：几个小时?无需变性、复性过程，获得有活性产品无需变性、复性过程，获得有活性产品?纯化过程：淘汰抗体亲和层析纯化过程：淘汰抗体亲和层析概述概述干扰素生产工艺干扰素生产工艺基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：3.4.2 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏基因工程假单胞杆菌的构建与保藏1、基因工程假单胞杆菌菌种建立1、基因工程假单胞
47、杆菌菌种建立2、基因工程假单胞杆菌菌种特性2、基因工程假单胞杆菌菌种特性3、菌种库的建立与保藏3、菌种库的建立与保藏工程菌构建工程菌构建干扰素生产工艺干扰素生产工艺1、基因工程假单1、基因工程假单胞胞杆菌菌种建立杆菌菌种建立第一步：干扰素-2b基因的克隆第一步：干扰素-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建第三步：工程菌的构建工程菌构建工程菌构建干扰素生产工艺干扰素生产工艺第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定
48、克隆。测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。1、基因工程假单1、基因工程假单胞胞杆菌菌种建立杆菌菌种建立ATGATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATG
49、AGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGATGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCA
50、GGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGA