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1、9.3 植物细胞培养制备代谢产物细胞代谢产物分为初级代谢产物、次级代谢产物。初级代谢产物初级代谢产物（Primary metabolites）是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。次级代谢产物次级代谢产物（Secondary metabolites）是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：苷类：皂苷、强心苷、干草甜苷、香豆精苷等。固醇：菜油固醇、豆固醇、谷固醇、胆固醇等。生物碱：吡啶、喹啉
2、、异喹啉等。醌类：蒽醌、萘醌、泛醌等。蛋白质类：氨基酸、蛋白质抑制剂、植物病毒抑制剂等。与通过植物栽培提取代谢产物的制备途径与通过植物栽培提取代谢产物的制备途径相比，通过植物细胞培养生产有价值代谢相比，通过植物细胞培养生产有价值代谢产物具有以下优点：产物具有以下优点：不受季节、环境、病虫害影响。不占耕地，适用于贫瘠的地方。代谢产物生产可以在可控条件下进行，可以通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代谢调控提高目标产物含量。9.3.1 细胞株筛选1、适合于工业化生产的细胞株必须满足以下条件：（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快 培养周期短 不易
3、染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。2、适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：（1）愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。（2）单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。（3）细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。（4）细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。（5）性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。（6）细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。3、细胞
4、株定向富集驯化 细胞株定向富集驯化是一种有效的筛选技术，主要包括：（1）激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。（2）耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度的乙酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物的培养基中反复继代培养驯化，不断提高这些成分含量，可以获得耐受高剂量有毒物质的细胞株。4、人工诱变筛选人工诱变筛选系统包括：（1）悬浮培养系统 广泛用于细胞突变体的筛选。（2）愈伤组织系统 当愈伤组织培养到一定阶段后，将愈伤组织进行诱变处理
5、，通过继代培养结合选择压力进行筛选。（3）原生质体系统 5、细胞株保存继代培养保存法 悬浮培养的细胞通过每隔12周换液进行一次继代培养。这种方法适合于短期保种。低温保存法 一般选择5-10的温度下培养，每隔十天左右更换一次培养液。冷冻保存 包括低温保存（-20）、超低温保存（液氮-196）。9.3.2 培养方法 对于植物细胞大规模培养常采用的是分批式培养、流加式培养。以分批式培养为例，一般情况下，细胞代谢产物与细胞生长的关系有3种模式:a生长偶联型：产物合成发生在细胞生长过程中，到达平台期后合成停止。b中间型：产物合成出现在细胞生长旺盛阶段，在平台期也能合成，但是速度减缓。c非生长偶联型：产物
6、合成出现在细胞生长平台期。1、分批式培养 是一种基本的培养方式，在实验室小规模培养中广泛使用。此培养方法需重点考虑营养消耗与细胞生长、目标产物积累的关系。2、流加式培养 植物细胞流加培养时，添加的可以是限制性底物，也可以是代谢产物的前体物质或诱导子，提高细胞浓度和目标产物产量。流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器3个单元所组成。3、两步法培养 由于大多数植物次级代谢产物在细胞生长停止后才大量合成，即属于非生长偶联型，植物细胞培养制备次级代谢产物一般采用两步法培养工艺。第一步采用利于细胞生长的培养基使细胞达到高的细胞浓度。第二部更换为利于产物合成
7、的培养基或添加代谢产物的前体物质或诱导子促进产物合成。4、两相培养 两相培养是一种有价值的产物促进释放技术。是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长合成次级代谢物质，分泌出来的产物被转移至有机相中。建立植物细胞的两相培养系统必须满足以下条件：（1）添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无 毒，不会影响细胞的生长和产物的合成。（2）产物能较容易地溶解于有机相中或吸附在多聚化合物上。（3）两相间的分离比较容易。（4）有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。5、无糖组织培养技术 无糖组织培养技术是由日本千叶大学的古在丰树教授上世
8、纪八十年代末发明。它是一种全新的植物组织培养技术，是环境控制技术和组织培养技术的有机结合。它以CO2代替糖作为植物体的碳源，利用工程技术手段调节组培微环境的空气、光照、温度、湿度等影响因子，促进植物光合作用，使组培植物由兼养型转变为自养型，从而促进植物的生长发育。但是目前该技术仅在少数植物（例如：咖啡、马铃薯、苦草）上获得成功。无糖组培生产工艺简单，流程缩短，技术和设备的集成度提高，降低了人工操作强度，更易于在规模化生产上推广应用。9.3.3 植物次级代谢产物的生物合成聚酮途径：又称乙酸丙二酸途径，乙酰辅酶A通过直线式聚合生成脂肪酸和环状次级代谢产物。聚酮类化合物的合成。莽草酸途径：磷酸烯醇丙
9、酮酸与4-磷酸赤藓糖缩合，经莽草酸生成芳香族氨基酸，进一步生成生物碱、类黄酮、香豆素等产物。甲戊二羟酸途径：又称甲瓦龙酸途径，是乙酰辅酶A经过甲戊二羟酸生成异戊二烯，再合成萜类、甾体、蒽醌等产物。9.3.4 次级代谢产物的分离提取细胞培养结束后采用过滤或离心将细胞与培养液分离，如果目标次级代谢产物存在细胞内，要经过细胞破碎后再分离提取。如果分泌到培养液中，则直接可以通过浓缩培养液进行分离提取。常用的分离提取方法包括经典方法和色谱分离方法，前者包括溶剂法、分馏法、沉淀法、升华法、膜分离法和结晶法等。色谱分离法是目前使用最广泛的方法，包括薄层色谱和柱色谱两大类。萃取分离包括有机溶剂提取、水溶剂提取
10、。应该根据水溶性或脂溶性极性大小选择合适的萃取剂。9.3.5 提高植物次级代谢产物产量的途径1、提高植物次级代谢产物产量需要考虑一些因素如下：细胞株 选择高产稳定的细胞株。培养工艺 诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件优化与控制、流加培养。培养技术 固定化培养技术、两步法培养、促进产物释放的两相培养技术。培养设备 选择或设计合适的生物反应器。2、影响产量的因素（1）生物因素 细胞株特性 稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。缺乏适合的细胞株
11、是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。细胞凋亡 细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。关键是要保证充足的营养供给以及避免 有害代谢产物的积累，这可以通过采用合适的培养工艺来实现。细胞团 细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。生物合成机制次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉 及多基因参与（基因簇
12、），机制非常复杂，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。化学因素 营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积聚目标产物。前体（precursor）指某一代谢中间体的前一阶段的物质。缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。诱导子 狭义诱导子：是指那些能够
13、与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子。诱导子从来源上可以分为外源性和内源性诱导子 后者是指在外界信号刺激下细胞合成的物质。从性质上可以分为生物与化学诱导子。反馈抑制 植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。采用流加培养、两相培养等工艺技术可以克服这个问题。物理因素 主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。光照：光
14、对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关 植物细胞培养一般在25左右进行。pH：会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。植物细胞液体培养的 pH 变化范围在 56 之间，最佳的起始 pH在5.55.8 之间。如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。工程技术问题 培养液的流变特性由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等
15、引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。气体传递 与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关。搅拌与剪切力 植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。剪切力影响的克服可以通过低剪切力的生物反应器开发与耐受高剪切力的细胞株筛选来实现。泡沫与器壁表面粘附性 与微生物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生 的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。可以采用消泡剂或机械去除。