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1、第三章第三章 细胞工程实验室配置及基本细胞工程实验室配置及基本(jbn)(jbn)技术技术1 1 实验设置实验设置2 2 基本基本(jbn)(jbn)技术要求无菌环境与无菌操作技术要求无菌环境与无菌操作3 3 培养条件培养条件4 4 离体培养的营养需求离体培养的营养需求第一页，共三十三页。1 1 实验室设置实验室设置(shzh)(shzh)细胞工程实验室必须满足三个基本的需要：细胞工程实验室必须满足三个基本的需要：l实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；l无菌操作；无菌操作；l控制控制(kngzh)(kngzh)培养。培养。第二页，共三十三页。1.1.
2、实验室设置实验室设置(shzh)(shzh)一一.实验室组成实验室组成 1 1基本实验室基本实验室 准备室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。明亮，通风条件好。接种室接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室培养室 培养室的功能是对离体材料培养室的功能是对离体材料(cilio)(cilio)进行控制培养。其首要要
3、求是要进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。第三页，共三十三页。1.1.实验室设置实验室设置(shzh)(shzh)一一.实验室组成实验室组成2 2辅助实验室辅助实验室 细胞学实验室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定其功能是对培养材料进行细胞学鉴定(jindng)(jindng)和研究。要求和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片
4、冲印。在有条件其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。的情况下可建立此实验室。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。第四页，共三十三页。1.1.实验室设置实验室设置(shzh)(shzh)一一.实验室组成实验室组成Culture roomPreparation roomsterilizingSterile operationCytology roomTransit
5、ion area实验室布局(bj)示意图第五页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备基本设备(shbi)(shbi)配置配置基本设备基本设备 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。搅拌器。灭菌设备灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热蒸汽压力灭菌锅、干热(n r)(n r)消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾 消毒器、紫外灯。消毒器、紫外灯。无菌操作设备无菌操作设备 净化工作台、接种箱。净化工作台、接种箱。光温控制设备光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。时间程序控制器、空调及温度感应器。细
6、胞培养设备细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、摇床、生物反应器等。生物反应器等。细胞学鉴定设备细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。第六页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本基本(jbn)(jbn)设备配置设备配置灭菌灭菌(mi jn)(mi jn)设备设备第七页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本基本(jbn)(jbn)设备配置设备配置无菌操作无菌操作(cozu)(cozu)设备设备第八页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置
7、二二.基本设备基本设备(shbi)(shbi)配置配置光光照照培培养养(p(piyiyng)ng)及及控控制制设设备备第九页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本基本(jbn)(jbn)设备配置设备配置第十页，共三十三页。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本基本(jbn)(jbn)设备配置设备配置第十一页，共三十三页。2.2.基本基本(jbn)(jbn)技术技术 一一.洗涤技术洗涤技术l洗涤液：洗涤液：弱弱 用重铬酸钾用重铬酸钾(zhn sun ji)(zhn sun ji)5050g g加入蒸馏水加入蒸馏水1 1L L，加热溶化，冷加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸却后再缓
8、慢加入浓硫酸9090mlml。中中 用重铬酸钾用重铬酸钾5050g g加入蒸馏水加入蒸馏水100100mlml，加热溶化，冷却后再加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸缓慢加入浓硫酸875875mlml。强强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1 1L L加入重铬酸钾加入重铬酸钾5050g g。第十二页，共三十三页。2.2.基本技术基本技术(jsh)(jsh)一一.洗涤技术洗涤技术l洗涤方法洗涤方法 玻璃器皿洗涤玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶
9、已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤塑料用品洗涤 一般一般(ybn)(ybn)用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。金属用品洗涤金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。焰干燥。第十三页，共三十三页。2.2.基本技术基本技术(jsh)(jsh)二二.灭菌、消毒灭菌、消毒 物理方法：物理方法：物理
10、灭菌物理灭菌 干热、湿热、射线处理干热、湿热、射线处理、过滤过滤(gul)(gul)、离心沉淀等离心沉淀等 化学方法：化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌消毒剂、抗菌素灭菌 外植体灭菌技术：外植体灭菌技术：对外植体伤害小，灭菌效对外植体伤害小，灭菌效 果好果好第十四页，共三十三页。2.2.基本基本(jbn)(jbn)技术技术 二二.灭菌、消毒灭菌、消毒 培养基：培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.玻璃器皿：玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热 至至1504015040分钟，或分钟，或12021202小时小时.金属器皿：金属器皿：干
11、热灭菌干热灭菌.接种室：接种室：接种室常采用定期接种室常采用定期(dngq)(dngq)熏蒸，熏蒸剂常用甲熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每醛加高锰酸钾，一般每100100mlml甲醛加甲醛加5 5g g高锰酸钾高锰酸钾.外植体：外植体：一般使用化学灭菌剂一般使用化学灭菌剂 灭菌灭菌.第十五页，共三十三页。几种几种(j zhn)(j zhn)常用消毒剂的效果比较常用消毒剂的效果比较消 毒 剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效 果残液去除难易次氯酸钙/纳10530好易新洁尔灭1020530好易氯化汞0.11210最好最难过氧化氢1012515较好最易抗菌素450mgl-13060较好较难
12、第十六页，共三十三页。3.3.培养条件培养条件(tiojin)(tiojin)一一.光照的影响光照的影响 光照光照(gungzho)(gungzho)时间时间 光照强度光照强度 光质光质第十七页，共三十三页。3.3.培养条件培养条件 二二.温度温度(wnd)(wnd)的影响的影响l在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当分裂速率，而适当(shdng)(shdng)提高温度则有利于细胞伸长，在提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓
13、，而且使细胞的质量增加。而且使细胞的质量增加。第十八页，共三十三页。温度对菊芋(j y)愈伤组织细胞生长的影响培养温度()接种时单个细胞平均鲜重(微克)到指数生长期末单个细胞重(微克)10.00.440.2015.00.420,1225.00.440.0730.00.420.0632.00.520.033.3.培养培养(piyng)(piyng)条件条件 二二.温度的影响温度的影响第十九页，共三十三页。3.3.培养条件培养条件(tiojin)(tiojin)三三.湿度的影响湿度的影响l组织培养中湿度的影响有两个方面：组织培养中湿度的影响有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，一是环境一是培养容器
14、内的湿度条件，一是环境(hunjng)(hunjng)的湿度条件。容器内的相对湿度几乎是的湿度条件。容器内的相对湿度几乎是100%100%；二是环境的相对湿度一般要求二是环境的相对湿度一般要求707080%80%。第二十页，共三十三页。3.3.培养培养(piyng)(piyng)条件条件 四四.pHpH值值l通常使用的通常使用的pHpH值范围是值范围是5.5.0 06.56.5。pHpH在在4.04.0以下以下(yxi)(yxi)或或7.07.0以上培养物就不能正常生长。以上培养物就不能正常生长。第二十一页，共三十三页。3.3.培养培养(piyng)(piyng)条件条件 五五.渗透压渗透压l
15、事实上为了某些培养事实上为了某些培养(piyng)(piyng)需要，在设计培养需要，在设计培养(piyng)(piyng)基时就应该考虑渗透压的问题，如基时就应该考虑渗透压的问题，如WhiteWhite培培养基的渗透压为养基的渗透压为0.150.15个大气压，个大气压，MSMS培养基为培养基为1.91.9个大气压。此外，培养基的渗透压除用蔗糖调节个大气压。此外，培养基的渗透压除用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨醇等。外，常用的还有甘露醇，山梨醇等。第二十二页，共三十三页。3.3.培养条件培养条件(tiojin)(tiojin)六六.气体影响气体影响COCO2 2、O O2 2 第二十三页，
16、共三十三页。3.3.培养条件培养条件(tiojin)(tiojin)六六.气体影响气体影响第二十四页，共三十三页。4.4.离体培养的营养离体培养的营养(yngyng)(yngyng)需求需求一一.无机盐类无机盐类二二.有机化合物有机化合物三三.植物激素植物激素(j s)(j s)四四.其它附加成分其它附加成分第二十五页，共三十三页。4.4.离体培养的营养离体培养的营养(yngyng)(yngyng)需求需求 一一.无机盐类无机盐类植物生长发育的基本元素植物生长发育的基本元素:N,P,K,Ca,Mg,S,Fe,Mn,B,N,P,K,Ca,Mg,S,Fe,Mn,B,Cu,Zn,Mo,Cl,C,H,
17、OCu,Zn,Mo,Cl,C,H,O。必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；活化剂，参与植物的代谢活动；三是这些三是这些(zhxi)(zhxi)元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程
18、中，影响组织器官的建成。四是在发育过程中，影响组织器官的建成。第二十六页，共三十三页。4.4.离体培养离体培养(piyng)(piyng)的营养需求的营养需求 一一.无机盐类无机盐类大量元素大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升几十至培养基的大量元素使用量一般在每升几十至 几千毫克几千毫克(ho k)(ho k)。大量元素包括。大量元素包括C,H,O,N,P,K,C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,S Ca,Mg,S微量元素微量元素 微量元素的用量一般低于微量元素的用量一般低于1010-5-51010-7-7克分子浓克分子浓 度。植物所需的微量元素有度。植物所需的微量元素有FeFe、CuC
19、u、ZnZn、B B、Mo Mo、MnMn、CoCo第二十七页，共三十三页。4.4.离体培养离体培养(piyng)(piyng)的营养需求的营养需求 二二.有机化合物有机化合物有机有机(yuj)(yuj)化合物化合物 糖；维生素；肌醇；氨基酸及糖；维生素；肌醇；氨基酸及其它如水解酪蛋白、水解乳蛋白等其它如水解酪蛋白、水解乳蛋白等 第二十八页，共三十三页。4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 三三.植物植物(zhw)(zhw)激素激素 生长素：生长素：IAAIAA、NAANAA、2,4-D2,4-D、IBAIBA等。等。细胞分裂素：细胞分裂素：KTKT、BABA、玉米玉米(ym)(ym)
20、素等。素等。其它：其它：GAGA3 3、ABAABA、B B9 9等。等。第二十九页，共三十三页。4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求(xqi)(xqi)四四.其它附加成分其它附加成分 琼脂琼脂(qingzh)(qingzh)活性炭等活性炭等 第三十页，共三十三页。4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求(xqi)(xqi)MS MS 培养基配方（培养基配方（mglmgl-1-1)KNO31900ZnSO4 7H2O8.6NH4NO31650NaMoO4 2H2O0.25MgSO4 7H2O370CuSO4 5H2O0.025CaCl2 2H2O440KI0.83KH2PO4170
21、CoCl2 6H2O0.025FeSO4 7H2O27.8Nicotinicacid0.5Na2-EDTA 2H2O37.3Glycine2.0MnSO4 4H2O22.3VB60.5H3BO36.2VB10.1第三十一页，共三十三页。l培养基的配制方法(fngf)在实验课具体讲述第三十二页，共三十三页。内容(nirng)总结第三章 细胞工程实验室配置及基本技术。外植体灭菌技术：对外植体伤害小，灭菌效 果好。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.。玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热。至15040分钟，或1202小时(xiosh).。接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲。外植体：一般使用化学灭菌剂 灭菌.。4.离体培养的营养需求 二.有机化合物。4.离体培养的营养需求 三.植物激素。培养基的配制方法在实验课具体讲述第三十三页，共三十三页。