《基因工程ppt第八章基因工程.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程ppt第八章基因工程.pptx（84页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第八章第八章 基因工程基因工程基因工程基因工程(genetic engineering)、基因、基因克隆、克隆、DNA重组、重组、DNA克隆、分子克隆克隆、分子克隆克隆（克隆（clone）无性繁殖无性繁殖应用酶学的方法，在体外将应用酶学的方法，在体外将目的基因目的基因与与载体载体DNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNA分分子（子（复制子、重组体复制子、重组体），继而通过转化或转），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其分子拷贝，或
2、其表达产物表达产物。基因克隆示意图基因克隆示意图基因工程大事记基因工程大事记1973 Cohen第一例成功的克隆实验第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上世界上第一种基因工程蛋白药物第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛重组人胰岛素在英、美获准使用素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国中国 转基因鱼转基因鱼 19931993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所英国罗斯林研究所 多莉羊多莉羊1999.9 中国获
3、准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作科学家公布人类基因组工作草图草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息生物技术工程：生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程酶工程、细胞工程*胰岛素胰岛素*人生长激素人生长激素*干扰素干扰素*白细胞介素白细胞介素2*粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子*粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子*红细胞生成素红细胞生成素 EPO*组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂*生长激素
4、生长激素*促生长素促生长素*抗血友病因子抗血友病因子*脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶*葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶*鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组基因重组基因重组(genetic recombination)整段整段DNA在细胞内或细胞间在细胞内或细胞间,甚至不同物甚至不同物种间进行交换种间进行交换,并能在新的位置上复制并能在新的位置上复制,转录和翻译转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的基因工程有目的结合作用结合作用质粒质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）细胞（细菌）转
5、化作用转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程过程转导作用转导作用 transduction病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径溶菌途径；溶原菌途径基因工程基因工程工具酶工具酶载体载体重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程真核细胞转染真核细胞转染克隆基因的表达克隆基因的表达工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平
6、3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶：常用的工具酶：一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获，获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖1953年，年，Arber研究噬菌体与细菌（研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。）的关系。发现发现100-200
7、个子代噬菌体中，只有个子代噬菌体中，只有1个可个可感染感染B，即其他的噬菌体在，即其他的噬菌体在B中受到限制，中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。成功。细菌细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。死亡。原因：细菌无法对自己的原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。进行修饰。假设：限制性内切酶与修饰酶。假设：限制性内切酶与修饰酶。1967年，年，Smith，分析限制性内切酶的识别和，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由切割序列，认为它由5-6个碱基组成个碱基组成原因：限制性酶将原因：限制性酶将T7DNA切成平均
8、长度为切成平均长度为1000碱基的片段。碱基的片段。识别和切割序列：中心对称的回文结构。识别和切割序列：中心对称的回文结构。限制性酶：限制性酶：HindNathans：用限制性酶切割猴子：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。测序。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)识别双链识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸内部特异位点并裂解磷酸二酯键二酯键分类：分类：型、型、型型、型型命名：命名：EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：株；：株；：发：发现次序现次序)识别和切割位点识别和切割位点回文结构回文结构 46 bp出现两种末端出现两种末端*粘
9、性末端粘性末端 粘端粘端*平头末端平头末端 平端平端 同工异源酶：同工异源酶：来源不同，但能识别和切来源不同，但能识别和切割同一位点割同一位点同尾酶：同尾酶：识别序列不同，但产生相同的识别序列不同，但产生相同的粘性末端粘性末端粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端修饰酶修饰酶DNA聚合酶聚合酶逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)T4DNA连接酶连接酶(T4 ligase)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)Taq DN
10、A聚合酶聚合酶DNA聚合酶(pol)的活性5至至3的聚合活性的聚合活性5 3方向方向核酸核酸 外切酶活性外切酶活性5 3外切酶活性外切酶活性3 5外切酶活性外切酶活性pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段大片段 （Klenow片段片段）：聚合活性、）：聚合活性、3 5外外切活性切活性 常用的工具酶核酸外切酶活性核酸外切酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性末端脱氧核末端脱氧核苷酰转移酶苷酰转移酶(TDT)载体载体 vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和，能在宿主细胞中进行自我复制和表达表达克隆载体、表达载体克隆载体、
11、表达载体原核载体原核载体：质粒：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（噬菌体（，M13）等）等真核载体真核载体：动物病毒载体：动物病毒载体pLXSN等等常用的克隆载体常用的克隆载体质粒质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的存在于细菌染色体外的小型环状双链小型环状双链DNA分子分子理想的质粒理想的质粒 *拷贝数多拷贝数多;*两三个遗传标志，如抗药性基因：两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素基因基因(ampr)、抗四环素基因抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷半乳糖苷酶基因酶基因(lac Z)筛选标志筛选标志*多个限制酶的单一切点，即多个限制酶的单一切点，即多克隆位点多克隆位点
12、(multiple cloning sites,MCS)常用的克隆载体常用的克隆载体噬菌体噬菌体(phage)基因组分三个区域：左侧区、基因组分三个区域：左侧区、中间区中间区（非必需区）、（非必需区）、右侧区右侧区DNA，替换型载体，外源，替换型载体，外源DNA：923kb常用：常用：EMBL 系列、系列、gt 系列、系列、charon系列系列粘性质粒粘性质粒(cosmid)：DNA的的 cos区区+质粒，双质粒，双链环状链环状DNA，克隆容量：，克隆容量：4050kbM13噬菌体噬菌体最大优点：产生单链最大优点：产生单链DNAcos:cohesive-end site特点：特点：RF DNA
13、:replicational form DNA优点：优点：表达载体表达载体(expressing vector)特点：带表达构件特点：带表达构件转录和翻译所需的转录和翻译所需的DNA序序列列大肠杆菌表达载体：含启动子大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位核糖体结合位点点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信号启动子：启动子：trp-lac(tac)启动子、启动子、噬菌体噬菌体PL启动子、启动子、T7噬菌体启动子噬菌体启动子核糖体结合位点核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起：起始密码子始密码子(ATG)和和SD序列序列转录终止序列转录终止序列哺乳动物表达载体哺
14、乳动物表达载体真核表达元件：启动子真核表达元件：启动子/增强子增强子克隆位克隆位点点终止信号和加终止信号和加poly(A)信号信号重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程目的基因的制备目的基因的制备载体的选择和制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接分子的体外连接将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定目的基因目的基因(target DNA)的制的制备备目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）制备基因组制备基因组DNA 基因文库基因文库(genomic library)存在于转化细菌存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组中、克隆载体携带的所有基因
15、组DNA的集合的集合制备制备cDNA cDNA文库文库(cDNA library)制备用于表达的基因片段：制备用于表达的基因片段：PCR技术、化技术、化学合成学合成载体的选择和制备：载体的选择和制备：噬菌体、粘性质噬菌体、粘性质粒、粒、pUC系列、系列、M13噬菌体噬菌体DNA分子的体外连接（分子的体外连接（DNA连接酶）连接酶）粘性末端连接粘性末端连接 连接效率高连接效率高*相同酶切末端相同酶切末端平端连接平端连接 连接效率低连接效率低人工接头人工接头(linker)法法同聚物接尾法同聚物接尾法同聚物接尾法同聚物接尾法将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞基因工程菌基因工程菌 HB101
16、,JM109转化转化(transformation)制备制备感受态细胞感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来摄取和容忍外来DNA的生理状态的生理状态感染感染(infaction)转导转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程遗传信息转移过程转染转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被：真核细胞主动摄取或被动导入外源动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。片段而获得新的表型的过程。目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法遗传学方
17、法插入灭活法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选抗药性标志选择择 标志补救标志补救 表达产物与营养缺陷互补表达产物与营养缺陷互补 *-互补互补 蓝白斑蓝白斑筛选筛选免疫学方法免疫学方法分子杂交分子杂交 探针探针原位杂交原位杂交 PCR限制性酶切图谱限制性酶切图谱 IPTG;X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 克隆基因的表达克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；载体有转录、翻译的元件；密码子通用密码子通用原核表达体系原核表达体系 原核表达载体的标准原核表达载体
18、的标准*合适的筛选标志合适的筛选标志*强启动子强启动子*翻译控制序列翻译控制序列*多克隆位点多克隆位点融合蛋白（融合蛋白（fusion protein,包涵体）包涵体）表达的蛋白质或多肽的表达的蛋白质或多肽的N末端由原核末端由原核DNA编码，编码，C末断由克隆的真核末断由克隆的真核DNA编目。编目。大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白很难表达大量的可溶性蛋白真核
19、表达体系真核表达体系转染方法转染方法磷酸钙沉淀磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔脂质体转染；人造膜脂质体转染；人造膜显微注射显微注射筛选标志筛选标志 tk-Neor G418瞬时转染瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组目的基因不整合进宿主基因组稳定转染稳定转染 目的基因整合进宿主基因组目的基因整合进宿主基因组tk-细胞突变株筛选转染细细胞突变株筛选转染细胞胞胸苷激酶（胸苷激酶（tk）TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成成HAT选择（选择（H：次黄嘌呤；：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；：氨甲喋呤；T：胸苷）：胸苷）tk+：生长：生长tk-+带带tk基因的质粒：生长基因的质粒：生长药物筛选转染细胞药物筛选转染细胞neor新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成合成G418：干扰原核、真核生物：干扰原核、真核生物neo：磷酸转移酶，使：磷酸转移酶，使G418失活失活neo 与目的基因连锁与目的基因连锁,转染转染目的基因的定点诱变及其应用目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术基因定点诱变技术基因定点诱变技术的应用基因定点诱变技术的应用