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1、基因工程原理第八章第1页，本讲稿共17页植物基因工程植物基因工程n植物基因工程比动物基因工程更成熟、更常规植物基因工程比动物基因工程更成熟、更常规 1)上百种不同植物种的基因转移，可以按照一种常规的程序进行；上百种不同植物种的基因转移，可以按照一种常规的程序进行；2)成熟的载体系统成熟的载体系统 根瘤杆菌为基础、直接根瘤杆菌为基础、直接DNA转移转移(操作植物基因组操作植物基因组)植物病毒载体植物病毒载体(瞬时高水平表达瞬时高水平表达)n原因：植物和动物的根本区别原因：植物和动物的根本区别 有组织的且分化的植物组织表现出很高的发育可塑性有组织的且分化的植物组织表现出很高的发育可塑性n产生转基因
2、植物的先决条件：某种形式的组织培养步骤产生转基因植物的先决条件：某种形式的组织培养步骤第2页，本讲稿共17页植物愈伤组织植物愈伤组织n愈伤组织，芽、根尖、茎结段或正在发愈伤组织，芽、根尖、茎结段或正在发芽的种子等外植体，置于适当的培养基芽的种子等外植体，置于适当的培养基中，长成的一种未分化的团块。愈伤组中，长成的一种未分化的团块。愈伤组织一旦形成，可通过分化无限增殖。织一旦形成，可通过分化无限增殖。n愈伤组织发育的基本要求：愈伤组织发育的基本要求：适当的植物激素适当的植物激素(种类和量的适当种类和量的适当)生长素、细胞分裂素、赤霉素生长素、细胞分裂素、赤霉素第3页，本讲稿共17页其它植物细胞培
3、养操作其它植物细胞培养操作n悬浮细胞悬浮细胞n原生质体原生质体n小植株小植株 第4页，本讲稿共17页植物基因操作概论植物基因操作概论n利用农杆菌属细菌的天然能力利用农杆菌属细菌的天然能力 将将DNA转入受染植物的基因组中转入受染植物的基因组中(稳定转化稳定转化)n直接转移直接转移DNA(瞬时或稳定转化瞬时或稳定转化)原生质体转化原生质体转化 DNA包被的散弹轰击包被的散弹轰击n植物病毒作为基因转移载体植物病毒作为基因转移载体 植物病毒从不整合到植物基因组植物病毒从不整合到植物基因组(瞬时转化瞬时转化)第5页，本讲稿共17页农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化n农杆菌与冠瘿病农杆菌与冠瘿病n冠瘿病与
4、致瘤质粒冠瘿病与致瘤质粒(Ti质粒质粒)nT-DNA与外源与外源DNA转化转化nTi载体载体 1)卸甲卸甲Ti载体载体 2)共整合载体共整合载体 3)双元载体双元载体 第6页，本讲稿共17页农杆菌与冠瘿病农杆菌与冠瘿病n农杆菌诱生冠瘿农杆菌诱生冠瘿一种植物肿瘤一种植物肿瘤n冠瘿病重要特征：冠瘿病重要特征：冠瘿碱的合成。细菌冠瘿碱的合成。细菌诱导特异冠瘿碱的诱导特异冠瘿碱的合成，作为其唯一合成，作为其唯一的碳源与氮源。的碳源与氮源。第7页，本讲稿共17页冠瘿组织特性冠瘿组织特性n真正的瘤性转变组织真正的瘤性转变组织n细菌被抗生素杀死后，细菌被抗生素杀死后，即使缺乏正常细胞体即使缺乏正常细胞体外培
5、养的植物激素，外培养的植物激素，也可生成愈伤组织也可生成愈伤组织n冠瘿组织特性维持不冠瘿组织特性维持不需要细菌的存在，存需要细菌的存在，存在某种在某种“肿瘤诱导要肿瘤诱导要素素”第8页，本讲稿共17页肿瘤诱导要素肿瘤诱导要素Ti质粒质粒n致瘤质粒致瘤质粒(Ti质粒质粒)，农杆菌中诱导植物冠瘿病的质粒。该，农杆菌中诱导植物冠瘿病的质粒。该质粒感染植物受伤部位细胞，并将其部分序列整合到植物质粒感染植物受伤部位细胞，并将其部分序列整合到植物基因组基因组DNA中。中。第9页，本讲稿共17页Ti质粒功能区域质粒功能区域nT-DNA区区n毒性区毒性区(T-DNA转转移区移区)n冠瘿碱利用区冠瘿碱利用区n复
6、制起始区复制起始区n质粒转移区质粒转移区第10页，本讲稿共17页T-DNAnTi质粒的一个特异质粒的一个特异片段，长约片段，长约23kb，可随机整合于植物可随机整合于植物核核DNA，携带有赋，携带有赋予转化后植物组织予转化后植物组织无限生长和合成冠无限生长和合成冠瘿碱的基因。这些瘿碱的基因。这些基因并非转化所必基因并非转化所必需，可由外源需，可由外源DNA取代。取代。第11页，本讲稿共17页T-DNA基因基因n冠瘿碱冠瘿碱合成基合成基因在载因在载体中可体中可用于筛用于筛选标记选标记第12页，本讲稿共17页边界序列边界序列:T-DNA转化的顺式转化的顺式必需序列必需序列nT-DNA两侧是两侧是2
7、5bp的不完的不完全正向重复序列，称作边全正向重复序列，称作边界序列。该序列，在章鱼界序列。该序列，在章鱼碱质粒和胭脂碱质粒中都碱质粒和胭脂碱质粒中都是保守的。边界序列不完是保守的。边界序列不完全转化入植物基因组全转化入植物基因组DNA，但是它们与转化过程有，但是它们与转化过程有关。关。n右连接区相当精确右连接区相当精确(必需必需)，左连接区可以有大约，左连接区可以有大约100bp的改变的改变(可能非必需可能非必需)第13页，本讲稿共17页毒性毒性(vir)区域区域:T-DNA转化的转化的反式必需基因反式必需基因第14页，本讲稿共17页卸甲卸甲Ti载体：去除致瘤性的载体：去除致瘤性的Ti载载体体(缺点：太大缺点：太大,操作不方便操作不方便)第15页，本讲稿共17页共整合载共整合载体：在农体：在农杆菌中整杆菌中整合合(缺点：缺点：共整合体共整合体太大太大)第16页，本讲稿共17页双元载体双元载体(在农杆菌中不整合在农杆菌中不整合)第17页，本讲稿共17页