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1、关于酶细胞原生质体固定化1第一页，本课件共有109页2直接应用酶的不足之处直接应用酶的不足之处1.1.酶的稳定性差酶的稳定性差2.2.一次性使用一次性使用3.3.分离纯化较困难分离纯化较困难第二页，本课件共有109页3固定化酶的优点固定化酶的优点1.1.酶的稳定性明显改善；酶的稳定性明显改善；2.2.酶的利用效率高；酶的利用效率高；3.3.易于分离纯化；易于分离纯化；4.4.反应条件易于控制；反应条件易于控制；5.5.适合于多酶催化反应。适合于多酶催化反应。第三页，本课件共有109页4第一节第一节 酶固定化酶固定化定义定义酶的固定化酶的固定化:是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶是通过物
2、理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。流动，但能使酶充分发挥催化作用。固定化酶固定化酶:固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶化反应的酶;概念发展概念发展“水不溶酶水不溶酶”（water insoluble enzyme)water insoluble enzyme)“固相酶固相酶”（solid phase enzyme)solid phase enzyme)19711971年第一届国际酶工程会议正式采用年第
3、一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（固定化酶（immobilized immobilized enzyme)”enzyme)”第四页，本课件共有109页5什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第五页，本课件共有109页6化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶第六页，本课件共有109页7固定化酶制备原则固定化酶制备原则（1 1）维持酶的催化活性及专一性；）维持酶的催化活性及专一性；（2 2）有利于生产自动化、连续化；）有利于生产自动化、连续化；
4、（3 3）应有最小的空间位阻；）应有最小的空间位阻；（4 4）酶与载体必须结合牢固；）酶与载体必须结合牢固；（5 5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应；反应液发生化学反应；（6 6）成本要低。）成本要低。第七页，本课件共有109页8酶的固定化方法（一）酶的固定化方法（一）固定化方法固定化方法 分类分类非共价结合法非共价结合法结晶法结晶法分散法分散法物理吸附法物理吸附法离子结合法离子结合法化学结合法化学结合法交联法交联法共价结合法共价结合法包埋法包埋法微囊法微囊法网格法网格法一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法第八页，本课件共有109
5、页9酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图第九页，本课件共有109页101 1、吸附法、吸附法(link)(link)2 2、包埋法、包埋法(link)(link)3 3、结合法、结合法(link)(link)4 4、交联法、交联法(link)(link)5 5、热处理法、热处理法(link)(link)go一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法第十页，本课件共有109页111、吸附法、吸附法通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用，将酶电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。固体吸
6、附剂固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等等;(1)(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用载体廉价易得，可反复使用;(2)(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.back第十一页，本课件共有109页12吸附法吸附法第十二页，本课件共有109页132、包埋法、包埋法l包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂借助于聚合助进剂(包括交联剂包括交联剂)的作用进行的作用进行聚合，酶被
7、包埋在聚合物中以达到固定化聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。l多孔载体多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等聚酰胺、火棉胶等(1)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法(2)(2)半透膜包埋法半透膜包埋法第十三页，本课件共有109页14第十四页，本课件共有109页152、包埋法、包埋法(1)凝胶包埋法凝胶包埋法l 天然凝胶天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差度较差l 合成凝胶合成凝胶强度高，耐温度、强度高，耐温度、pHpH值变化强，因需聚合值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活反应而使部分酶变性失活l
8、 适用性：适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化定化第十五页，本课件共有109页16如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙第十六页，本课件共有109页17凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光
9、交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点第十七页，本课件共有109页18聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸钾(引发剂)，混合，于25：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶
10、的珠状凝胶。(1)凝胶包埋法凝胶包埋法第十八页，本课件共有109页19l聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙聚丙烯酰胺凝胶包埋法：烯酰胺凝胶包埋法：l APlAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)l TEMED第十九页，本课件共有109页20海藻酸钙包埋法装置海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中
11、（常用入凝固浴中（常用CaClCaCl2 2溶液），使海溶液），使海藻酸钠中的藻酸钠中的NaNa+，部分被，部分被CaCa2+2+所取代而所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控第二十页，本课件共有109页21l海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：l 滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)第二十一页，本课件共有109页22卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法：l卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具
12、体方法：将酶在37-50溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40-60 溶于生理盐水中，二者混合后，趁热滴在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。第二十二页，本课件共有109页23 卡拉胶包埋法：卡拉胶包埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法第二十三页，本课件共有109页24(2)半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小几十埃，比酶分子直径小适用性适用性底物和产物都是小分子物质的酶底物和产物都是小分子物质的酶2、
13、包埋法、包埋法第二十四页，本课件共有109页25微型胶囊法微型胶囊法微型胶囊法微型胶囊法第二十五页，本课件共有109页26微胶囊型固定化酶微胶囊型固定化酶制制备备酶酶+亲水性单体溶于水亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液疏水性单体溶于有机溶液混合混合乳乳化化剂剂乳化乳化酶液分散成小水滴酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋半透膜，将酶包埋Tween-20 破乳破乳离心离心半透膜半透膜酶液滴酶液滴第二十六页，本课件共有109页273、结合法、结合法选择适宜的载体选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键通过载体的共价键或离子键(非
14、共价非共价健健)与酶结合在一起的固定化方法与酶结合在一起的固定化方法酶酶载体载体(1)离子键结合法离子键结合法载体载体:DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、TEAE-TEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶等葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂不溶于水的离子交换剂操作操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少活力损失少,结合力较弱，条件结合力较弱，条件(pH(pH值和离子强度值和离子强度)改变改变时时,酶易脱落酶易脱落第二十七页，本课件共有109页28(1)离子键结合法离子键结
15、合法第二十八页，本课件共有109页29(2)(2)共价键结合法共价键结合法载体分类载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等等;也可分三类也可分三类:天然有机载体天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机物多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）方法方法载体活化载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间结合很牢固，酶可连续使用较长时
16、间缺点缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性响酶的催化活性3、结合法、结合法第二十九页，本课件共有109页30载体活化方法载体活化方法1 1、重氮法、重氮法;2 2、叠氮法、叠氮法;3 3、溴化氰法、溴化氰法;4 4、烷基化法、烷基化法.第三十页，本课件共有109页31重氮法重氮法将含有将含有苯氨基苯氨基的不的不溶性载体与溶性载体与亚硝酸亚硝酸反应生成重氮盐衍反应生成重氮盐衍生物，使载体引进生物，使载体引进了活泼的重氮基团了活泼的重氮基团第三十一页，本课件共有109页32叠氮法叠氮法含有含有酰肼酰肼基团的载体可用基团的载体可用亚
17、硝酸亚硝酸活化，生成叠氮活化，生成叠氮化合物化合物第三十二页，本课件共有109页33溴化氰法溴化氰法含有含有羟基羟基的载体，如纤维素等，可用的载体，如纤维素等，可用溴化氰溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物活化生成亚氨基碳酸衍生物第三十三页，本课件共有109页34烷基化法烷基化法含含羟基羟基的载体可用的载体可用三氯三氯-均三嗪均三嗪等多卤代物进行等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体活化，形成含有卤素基团的活化载体back第三十四页，本课件共有109页354、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构交联作用，制成网状结构特点：特点：此法
18、与共价结合法一样也是此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体不使用载体双功能试剂：双功能试剂：戊二醛、己二胺、双戊二醛、己二胺、双偶氮苯等偶氮苯等酶酶双功双功能剂能剂第三十五页，本课件共有109页36双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H4、交联法、交联法第三十六页，本课件共有109页37 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，
19、不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。第三十七页，本课件共有109页38第三十八页，本课件共有109页39戊二醛戊二醛:优点：优点：结合牢固，可以长时间使用结合牢固，可以长时间使用缺点：缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便用不便双重固定化双重固定化将其与吸附法、包埋法联将其与吸附法、包埋法联合使用合使用第三十九页，本课件共有109页40酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载
20、体上形成水不溶性的固定化酶back第四十页，本课件共有109页415、热处理法、热处理法在一定温度下加热处理一段时间，使酶固在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内定在菌体体内适用性适用性热稳定性较好的酶的固定化热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间严格控制加热及其时间back第四十一页，本课件共有109页42 酶的四种固定化方法酶的四种固定化方法第四十二页，本课件共有109页43第四十三页，本课件共有109页44第四十四页，本课件共有109页45固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法 共价结共价结合法合法交联法交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备难易制备难易
21、易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能可能可能不能不能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较第四十五页，本课件共有109页46固定化方法的比较l吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。作稳定性差。l共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。易引起细胞的破坏
22、。l交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。再生，不适于实际应用。l包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。底物。第四十六页，本课件共有109页471 1、稳定性、稳定性(link)(link)2 2、最适温度、最适温度(link)(link)3 3、最适、最适pH(link)pH(link)4 4、底物特异性、底物特异性(link)(link)go二、固定化酶的特性二、固定化酶的特性第四十七
23、页，本课件共有109页481、稳定性、稳定性相对游离酶的优点相对游离酶的优点（1 1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度A固定化酶固定化酶B游离酶游离酶第四十八页，本课件共有109页49（2 2）保存稳定性好，保存时间延长）保存稳定性好，保存时间延长（3 3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解酶水解（4 4）对变性剂）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍如尿素、有机溶剂、盐酸胍等等)的耐受性提高，保留较高酶活的耐受性提高，保留较高酶活（5 5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pHpH稳定性提高稳定性提高.1、稳定
24、性、稳定性第四十九页，本课件共有109页50 可能的原因：可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；可防止酶分子伸展变形；抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。的侵袭。1、稳定性、稳定性第五十页，本课件共有109页512、最适温度、最适温度与游离酶差不多与游离酶差不多A固定化酶固定化酶B游离酶游离酶第五十一页，本课件共有109页52例外例外1.1.用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高比游离酶高5-10;
25、5-10;2.2.以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-5-1515；3.3.汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80 80 ，比固定化前提高了，比固定化前提高了30 30 同一种酶同一种酶2、最适温度、最适温度第五十二页，本课件共有109页53不同方法和载体固定化氨基酰不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度化酶的最适温度(back)载体载体 方法最适温度最适温度(）游离游离 60 60DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶离子键结合法离子键结合法 72 72DEAE-DEAE-纤维素纤维素离子键
26、结合法离子键结合法 67 67DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶烷基化法烷基化法 60 60第五十三页，本课件共有109页543、最适、最适pH值值酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pHpH和酶和酶pHpH曲线曲线常发生偏移，原因是微环境表面电荷性质的影响常发生偏移，原因是微环境表面电荷性质的影响pHpH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响第五十四页，本课件共有109页55带负电荷的载体，带负电荷的载体，固定化酶最适固定化酶最适pH值值比游离酶的高比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适载体的带电性质对最适pH的影响的影响原因原因:吸引作用
27、吸引作用带正电荷的载体，固带正电荷的载体，固定化酶最适定化酶最适pH值比值比游离酶的低游离酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微偏酸微环境环境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大环境偏碱大环境偏碱酶酶不带电荷的载体，固定化酶最适不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变值一般不变第五十五页，本课件共有109页56(2)产物酸碱性对最适产物酸碱性对最适pH值的影响值的影响酸性酸性:固定化酶的最适固定化酶的最适pHpH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性:固定化酶的最适固定化酶的最适pHpH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性:固定化酶的最适固定化酶的最适pHpH值一般不变值一般不变原
28、因原因:载体障碍产物的扩散载体障碍产物的扩散(back)第五十六页，本课件共有109页574、底物的特异性、底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的作用
29、仅为游离酶的3%3%左右左右原因原因:载体的空间位阻作用载体的空间位阻作用(back)第五十七页，本课件共有109页58影响固定化酶性能的因素影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质质(1)(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化基、高级结构和电荷状态等发生变化(2)(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等
30、引起的变化化第五十八页，本课件共有109页59第五十九页，本课件共有109页60第六十页，本课件共有109页61三、固定化酶的应用三、固定化酶的应用1 1、工业生产、工业生产(link)(link)2 2、酶传感器、酶传感器(link)(link)3 3、药物控释载体（、药物控释载体（link)link)go第六十一页，本课件共有109页62现已用于工业生产的固定化酶主要有：氨基酰化酶 葡萄糖异构酶天门冬氨酸酶青霉素酰化酶延胡索酸酶 半乳糖苷酶天冬氨酸脱羧酶固定化酶在工业生产上的应用第六十二页，本课件共有109页631、固定化酶在工业生产中的应用、固定化酶在工业生产中的应用(1)(1)氨基酰化
31、酶氨基酰化酶Aminoacylase首例，首例，19691969年，日本田边制药公司，年，日本田边制药公司，DEAE-DEAE-葡聚葡聚糖凝胶固定化酶糖凝胶固定化酶,拆分拆分DL-DL-乙酰氨基酸，连续生乙酰氨基酸，连续生产产L-aaL-aa，成本降低，成本降低40%40%左右。左右。乙酰乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酸乙酰乙酰-D Ala第六十三页，本课件共有109页64泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala第六十四页，本课件共有109页65(2)(2)葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶世界上生产规模
32、最大。热世界上生产规模最大。热处理法进行固定化。处理法进行固定化。19731973年，已用于工业化年，已用于工业化生产。国内外广泛研究生产。国内外广泛研究和应用。和应用。1、固定化酶在工业生产中的应用、固定化酶在工业生产中的应用第六十五页，本课件共有109页66(3)(3)天冬氨酸酶天冬氨酸酶19731973年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌，采用包埋法，将延胡索酸力天冬氨酸酶的大肠杆菌，采用包埋法，将延胡索酸转化成转化成L-L-天冬氨酸。天冬氨酸。19781978年，角叉菜胶固定化纯酶，年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合
33、法。离子键结合法。1、固定化酶在工业生产中的应用、固定化酶在工业生产中的应用第六十六页，本课件共有109页67(4)(4)青霉素酰化酶青霉素酰化酶19731973年，催化青霉素或头孢菌素水解年，催化青霉素或头孢菌素水解6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-APA(6-APA）或）或7-7-氨基头孢霉烷酸氨基头孢霉烷酸(7-ACA),(7-ACA),也可催化也可催化6-APA6-APA或或7-ACA7-ACA与其他羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头与其他羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素孢霉素;(5)(5)延胡索酸酶延胡索酸酶19741974年，由延胡索酸制造年，由延胡索酸制造L-
34、L-苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌。产氨短杆菌。19771977年，由延胡索酸制年，由延胡索酸制L-L-苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄色短杆菌色短杆菌1、固定化酶在工业生产中的应用、固定化酶在工业生产中的应用第六十七页，本课件共有109页68(6)-(6)-半乳糖苷酶半乳糖苷酶19771977年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶(7)(7)天门冬氨酸天门冬氨酸-脱羧酶脱羧酶19821982年，天门冬氨酸生产年，天门冬氨酸生产L-L-丙氨酸。假单孢丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋菌，凝胶包埋Back1、固定化酶在工业生产中的
35、应用、固定化酶在工业生产中的应用第六十八页，本课件共有109页692、固定化酶在酶传感器方面的应用、固定化酶在酶传感器方面的应用酶传感器：固定化酶酶传感器：固定化酶+能量转换器能量转换器(电极、电极、场效应管、离子选择场效应管场效应管、离子选择场效应管)，属于，属于生物生物传感器传感器的一种的一种酶电极酶电极:固定化酶固定化酶+电极，应用最广泛电极，应用最广泛;用途用途:临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测go第六十九页，本课件共有109页70生物传感器生物传感器用生物活性材料（酶、蛋白质、用生物活性材料（酶、蛋白质、DNADNA、抗体、抗原、抗体、抗原、生
36、物膜等）与物理、化学传感器有机结合的一门交叉学科，生物膜等）与物理、化学传感器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控手是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控手段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法;在未来在未来2121世纪生物经济发展中，生物传感技术将是介世纪生物经济发展中，生物传感技术将是介于于信息和生物技术信息和生物技术之间的新增长点之间的新增长点;中国生物传感器中国生物传感器的研究起步于的研究起步于 7070年代末期年代末期 。早期研究。早期研究普遍采取氧电极作生物反应中的换能器普遍采取氧电极作生物反应
37、中的换能器 ,以葡萄糖氧化酶以葡萄糖氧化酶为活性材料为活性材料1、概述、概述第七十页，本课件共有109页71生物传感器生物传感器(续续)l传感器传感器能将一种被测信号（参量）转换成一种可能将一种被测信号（参量）转换成一种可输出信号的装置输出信号的装置。l生物传感器生物传感器(biosensors):(biosensors):用生物成分作为感受器用生物成分作为感受器的传感器。由感受器、换能器、电子线器组成的传感器。由感受器、换能器、电子线器组成2、生物传感器组成和工作原理、生物传感器组成和工作原理第七十一页，本课件共有109页72感知固定化配基与感知固定化配基与待测物结合产生的待测物结合产生的微
38、小变化，把这种微小变化，把这种变化转化为其它可变化转化为其它可识别信号，其质量识别信号，其质量好坏决定了传感器好坏决定了传感器的灵敏度。的灵敏度。换能器换能器是生物传感器的心脏，整是生物传感器的心脏，整个生物传感器的核心技术个生物传感器的核心技术也在此。制备分两方面工也在此。制备分两方面工作，一是选择最佳载体材作，一是选择最佳载体材料（需活化）；二是在载料（需活化）；二是在载体表面固定化亲和配基体表面固定化亲和配基（非共价和共价）（非共价和共价）感受器感受器第七十二页，本课件共有109页73食品鲜度食品鲜度鱼鲜度传感器鱼鲜度传感器 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的在日本、加拿大等国广泛用于
39、鱼类鲜度的测定。鱼死后体内测定。鱼死后体内ATPATP经酶解依次形成经酶解依次形成ADPADP、AMPAMP、IMPIMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K K值表示：值表示：K=K=肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤+尿酸尿酸第七十三页，本课件共有109页74 大多数鱼死后大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP和和AMPAMP已分解尽，超过已分解尽，超过24h24h，鲜度主要取决于，鲜度主要取决于IMP-IMP-肌苷肌苷-次黄嘌呤次黄嘌呤-尿酸。尿酸。将这
40、三个步骤的三种酶（将这三个步骤的三种酶（55核苷酸核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。l 当当K K2020时，鱼极新鲜，可供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。l K K在在20204040之间为新鲜，必须熟食。之间为新鲜，必须熟食。l K K大于大于4040，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。验结果相一致。第七十四页，本课件共有109页75肉鲜度传感器肉鲜度传感器l肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜
41、程度。类测定能反映肉类的新鲜程度。l用用腐胺氧化酶腐胺氧化酶与与过氧化氢电极过氧化氢电极构成多胺生构成多胺生物传感器，或用物传感器，或用单胺氧化酶膜单胺氧化酶膜和和氧电极氧电极组组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。第七十五页，本课件共有109页76污染微生物及病原菌的检测污染微生物及病原菌的检测l1通通过过免免疫疫学学方方法法，即即获获得得相相应应的的特特异异性性抗原和抗体进行分析和检测。抗原和抗体进行分析和检测。第七十六页，本课件共有109页77葡萄糖氧化酶电极葡萄糖氧化酶电极19621962年年 ClarkClark和和LyonsLyons提出提出
42、模型模型19671967年年 UpdikeUpdike和和HicksHicks首首先制造先制造聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜强度化葡萄糖氧化酶，酶膜强度20-5020-50m m基本结构基本结构酶膜酶膜+多分子膜多分子膜(聚四氟己烯等聚四氟己烯等)+)+氧电极氧电极葡萄糖氧化酶电极葡萄糖氧化酶电极第七十七页，本课件共有109页78 半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O第七十八页，本课件共有109页79葡萄糖醌H2O 葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极第七十九页，本课件共有109页Glucose
43、Gluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，可的量，可以用氧电极、以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。第八十页，本课件共有109页81脲电极Urea+2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的产生的2NH4+为阳离子电极感应。为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶
44、产生NH3第八十一页，本课件共有109页82青霉素酶电极青霉素酶电极酶膜酶膜:青霉素酶青霉素酶+聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(或光交联树脂或光交联树脂)电极电极:pHpH电极电极结合结合:酶膜紧贴在玻璃酶膜紧贴在玻璃(pH)(pH)电极上电极上反应反应:青霉素青霉素+H2O 青霉烷酸青霉烷酸+H+青霉素酶青霉素酶第八十二页，本课件共有109页833、药物控释载体、药物控释载体药物应用临床不顺利的原因药物应用临床不顺利的原因:l蛋白类药物被胃酸破坏蛋白类药物被胃酸破坏l被肝和血液中的酶系统清除被肝和血液中的酶系统清除l药物本身毒副作用药物本身毒副作用l免疫问题免疫问题l药物稳定性差药物稳定性差建
45、立合理的给药体系，核心是从时间和建立合理的给药体系，核心是从时间和空间分布上控制药物的释放空间分布上控制药物的释放第八十三页，本课件共有109页843、药物控释载体、药物控释载体控释体系涉及到将药物与聚合物载体偶联或控释体系涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，也称载体药物固定于某种聚合物载体上，也称载体药物 (1)(1)聚合物修饰聚合物修饰 (2)(2)凝胶包埋凝胶包埋 (3)(3)微球制剂微球制剂 (4)(4)脂质体脂质体 (5)(5)导向药物导向药物Back第八十四页，本课件共有109页854、固定化酶在医学上的应用、固定化酶在医学上的应用（1）消血栓：消血栓：n纤溶酶是
46、异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。能自由进出。第八十五页，本课件共有109页86（2 2）人工肾：）人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。囊活性炭组成人工肾。
47、第八十六页，本课件共有109页87第二节 细胞固定化分类方分类方式式固定化固定化细胞细胞分类方分类方式式固定化细胞固定化细胞细胞类细胞类型型微生物微生物植物植物动物动物生理状生理状态态死细胞死细胞:完整细胞完整细胞,细细胞碎片胞碎片,细胞器细胞器活细胞活细胞:增殖细胞增殖细胞,静静止细胞止细胞,饥饿细胞饥饿细胞第八十七页，本课件共有109页88 固定化细胞固定化细胞固定化细胞固定化细胞的定义的定义的定义的定义 固定在载体上并在一定空间范围内能固定在载体上并在一定空间范围内能固定在载体上并在一定空间范围内能固定在载体上并在一定空间范围内能进行生命活动的细胞。进行生命活动的细胞。进行生命活动的细胞
48、。进行生命活动的细胞。固定化活细胞固定化活细胞固定化活细胞固定化活细胞能进行正常的生长、繁能进行正常的生长、繁能进行正常的生长、繁能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。殖和新陈代谢。殖和新陈代谢。殖和新陈代谢。第二节第二节 细胞固定化细胞固定化第八十八页，本课件共有109页89 固定化细胞的特点固定化细胞的特点细胞特性细胞特性+生物催化剂生物催化剂+固相催化剂固相催化剂 无须进行酶的分离纯化无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收率高保持酶的原始状态，酶回收率高 比固定化酶稳定性高比固定化酶稳定性高 细胞内酶附助因子可再生细胞内酶附助因子可再生 细胞本身含多酶体系细胞本身含多酶体系 抗污染能
49、力强抗污染能力强优优点点第八十九页，本课件共有109页90一、细胞固定化的方法一、细胞固定化的方法 吸附法吸附法 包埋法包埋法第九十页，本课件共有109页911、吸附法、吸附法l 酵母细胞：酵母细胞：pH3-5多孔陶瓷多孔陶瓷l 植物细胞：中空纤维植物细胞：中空纤维l 动物细胞：动物细胞：第九十一页，本课件共有109页922、包埋法、包埋法l琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法l海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法l角叉菜胶包埋法角叉菜胶包埋法l明胶包埋法明胶包埋法l聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法l光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法第九十二页，本课件共有109页93二、微生物细胞固定化二、微生
50、物细胞固定化l细胞完整细胞完整l代谢调控代谢调控l发酵稳定发酵稳定l密度高密度高l质粒稳定质粒稳定（一）固定化微生物细胞的特点（一）固定化微生物细胞的特点第九十三页，本课件共有109页94二、微生物细胞固定化二、微生物细胞固定化1.利用固定化微生物生产各种产物利用固定化微生物生产各种产物酒类、氨基酸、有机酸、酶和辅酶、抗生酒类、氨基酸、有机酸、酶和辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理、维生素等。素、甾体转化、废水处理、维生素等。（二）固定化微生物细胞的应用（二）固定化微生物细胞的应用第九十四页，本课件共有109页952.固定化微生物细胞制造微生物传感器固定化微生物细胞制造微生物传感器呼吸活性测定型