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1、CompanyLOGO关于关于酶细胞原生胞原生质体的固定化体的固定化第一页，本课件共有78页CompanyL第二页，本课件共有78页CompanyLv固定化生物技术固定化生物技术v 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。并可反复利用。第三页，本课件共有78页CompanyL游离酶的缺点游离酶的缺点v1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。溶剂对其有影响）。v2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。v
2、3.分离纯化困难。分离纯化困难。第四页，本课件共有78页CompanyL第一节第一节酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化v一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点v 1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)v 固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。催化反应的酶。第五页，本课件共有78页CompanyL什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第六页，本课件共有78页CompanyL优点：优点：(1)(1)可提高
3、稳定性。可提高稳定性。(2)(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。第七页，本课件共有78页CompanyL 2.2.固定化细胞（固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行生命固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。第八页，本课件共有78页CompanyL 优越性：优越性：(1)(1)降低成本，省
4、去酶的分离纯化工作降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性：局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。产物。(2)(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。作用。第九页，本课件共有78页CompanyL 3.3.固定化原生质体固定化原生质体 意义：意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产有利于
5、氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。物的分泌。(2)(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高由于载体的保护作用，稳定性提高。第十页，本课件共有78页CompanyL 二、固定化方法二、固定化方法固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子交离子交换吸附换吸附物理物理吸附法吸附法第十一页，本课件共有78页CompanyL 依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离
6、子交换剂用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。上。1.1.吸附法（吸附法（adsorptionadsorption）第十二页，本课件共有78页CompanyL 根据吸附剂的特点分根据吸附剂的特点分:1 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：作用力：氢键、疏水键氢键、疏水键常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2 2）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：作用力：离子
7、键离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素第十三页，本课件共有78页CompanyL优点：优点：条件温和，操作简条件温和，操作简便，酶活力损失少。便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸附结合力弱，易解吸附。第十四页，本课件共有78页CompanyL 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。2.2.共价偶联法（共价偶联法（covalent binding or covalent covalent binding or c
8、ovalent couplingcoupling）第十五页，本课件共有78页CompanyL 1 1）载体：亲水载体优于疏水载体）载体：亲水载体优于疏水载体如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙第十六页，本课件共有78页CompanyL2 2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体：载体：功能基团：功能基团：芳香氨基，羧基，芳香氨基，羧基，羧甲基等。羧甲
9、基等。酶分子酶分子:侧链非必需基团：侧链非必需基团：羧基，巯羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。基，羟基，酚基，咪唑基。第十七页，本课件共有78页CompanyL 常用的偶联反应有：常用的偶联反应有：重氮化法、重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。等。第十八页，本课件共有78页CompanyL优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。间构象而影响酶的催化活性。第十九页，本课件共有78页CompanyL3.3.交联法（交联
10、法（crosslinkingcrosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。联的固定化方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第二十页，本课件共有78页CompanyL 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与酶个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨或蛋白质的游离氨基反应基反应,使酶蛋白使酶蛋白交联。交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。第二十一页，本课件共有78页CompanyL 交联反应既能
11、发生在分子间，也可发生在交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。分子内。酶酶浓浓度度低低时时，交交联联发发生生在在分分子子内内，酶酶仍仍保保持溶解状态。持溶解状态。酶酶浓浓度度高高时时，交交联联发发生生在在分分子子间间，酶酶变变为为不不溶溶态态。第二十二页，本课件共有78页CompanyL 缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。第二十三页，本课件共有78页CompanyL4.4.包埋法（包埋法（entrapme
12、ntentrapment）将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：网格型：将酶包埋在高分将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高分将酶包埋在高分子半透膜中。子半透膜中。第二十四页，本课件共有78页CompanyL1）网格型包埋法（网格型包埋法（gel(lattic)entrapmentgel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变
13、差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点第二十五页，本课件共有78页CompanyL海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：APAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED第二十六页，本课件共有78页CompanyL2
14、 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation）又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径半透膜孔径 80%80%活性活性。第四十二页，本课件共有78页CompanyL （三）酶的最适温度三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多多数数酶酶固固定定化化后后热热稳稳定定性性上上升升，最最适适温温度度也上升（有例外）。也上升（有例外）。（四）酶
15、的最适（四）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移。向碱性偏移。带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。第四十三页，本课件共有78页CompanyL 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性随载体的带电性能变化。能变化。固定化载体与底物电荷相反固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值降低。值降低。固定化载体与底物电荷相同固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表固定化酶的表观观K Km m值显著增加。值显著增加。（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征第四十四页，本课
16、件共有78页CompanyL 与自然酶基本相同。与自然酶基本相同。但大分子底物但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。改变。（六）酶的作用专一性（六）酶的作用专一性 第四十五页，本课件共有78页CompanyL 与固定化酶相比，固定化细胞的情况与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。比较复杂。（1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞的性质二、固定化细胞的性质 第四十六页，本课件共有78页CompanyL (一一)酶
17、酶(细胞细胞)的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。(二二)蛋白总量蛋白总量 1.1.双辛可宁酸法双辛可宁酸法(BCA(BCA法法)2.2.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 三、固定化酶（细胞）的评价指标三、固定化酶（细胞）的评价指标 第四十七页，本课件共有78页CompanyL (三三)偶联率及相对活力偶联率及相对活力 偶联率偶联率=(=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/)/加入蛋白活力加入蛋白活力100%100%活力回收活力回收=固定化酶总
18、活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力100%100%相对活力相对活力=固定化酶总活力固定化酶总活力/(/(加入酶的总活加入酶的总活力力-上清液中未偶联酶活力上清液中未偶联酶活力)100%)100%第四十八页，本课件共有78页CompanyL (四四)半衰期半衰期 在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶(细胞细胞)的活的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以以t t1/21/2表示。表示。是衡量稳定性的一项重要指标。是衡量稳定性的一项重要指标。第四十九页，本课件共有78页CompanyL乙酰乙酰-DL Ala L Ala
19、+乙酸乙酸乙酰乙酰-D Ala第三节 固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1.氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶第五十页，本课件共有78页CompanyL泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶体 L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第五十一页，本课件共有78页CompanyL 2.2.葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模世界上生产规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。第五十二页，
20、本课件共有78页CompanyL二、固定化酶在医学上的应用二、固定化酶在医学上的应用 1.消血栓：消血栓：n纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。应，无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。进出。第五十三页，本课件共有78页CompanyL2.2.人工肾：人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨
21、，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。和微胶囊活性炭组成人工肾。第五十四页，本课件共有78页CompanyL第五十五页，本课件共有78页CompanyL1.1.酶传感器酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分析检测中的应用三、在分析检测中的应用第五十六页
22、，本课件共有78页CompanyL SensitiveandspecificSensitiveandspecific RapidRapid SimpleSimpleBiosensorBiosensor第五十七页，本课件共有78页CompanyL 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器世界上第一个生物传感器葡萄糖氧葡萄糖氧化酶电极化酶电极。第五十八页，本课件共有78页CompanyL 葡萄糖酶电极 酶电极示意图
23、D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极第五十九页，本课件共有78页CompanyLGlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧电极、可以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。第六十页，本课件共有78页CompanyL继酶传感器（继酶传感器（enzyme sensore
24、nzyme sensor）后，又出现：）后，又出现：v细胞器传感器（细胞器传感器（cell organelle sensorcell organelle sensor）v组织传感器组织传感器（tissue sensortissue sensor）v微生物传感器微生物传感器（microbe sensormicrobe sensor）v免疫传感器（免疫传感器（immunosensorimmunosensor）第六十一页，本课件共有78页CompanyL1）酶传感器的原理v生物传感器生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪等
25、）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。器。第六十二页，本课件共有78页CompanyL第六十三页，本课件共有78页CompanyL生物识别元件生物识别元件(Biological recognition element)(Biological recognition element)v 是酶、抗原是酶、抗原(体体)、细胞器、组织切、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。质有选择性的分子识别能力。第六十四页，本课件共有78页CompanyL 换能器换能器(Transdu
26、cer)(Transducer)将识别元件上进行的生化反应中将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系比例关系。第六十五页，本课件共有78页CompanyL第六十六页，本课件共有78页CompanyL酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器酶传感器主要由主要由固定化酶膜和变换器固定化酶膜和变换器组成：组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质发并催化被检测物质发生化学反应；生化学反应；变换器：变换器：把催化反应中底物或产物的变量转
27、换成电信把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。号，通过仪表显示出来。第六十七页，本课件共有78页CompanyL第六十八页，本课件共有78页CompanyL2）酶传感器的应用）酶传感器的应用v水质监测水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物可检测大多数酚类化合物。第六十九页，本课件共有78页CompanyL德国研发的环境废水德国研发的环境废水BODBO
28、D分析仪分析仪第七十页，本课件共有78页CompanyL医疗方面医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。可测定血液中葡萄糖浓度。第七十一页，本课件共有78页CompanyL手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪第七十二页，本课件共有78页CompanyLn食品鲜度食品鲜度鱼鲜度传感器鱼鲜度传感器 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼
29、死后体内的测定。鱼死后体内ATPATP经酶解依次形成经酶解依次形成ADPADP、AMPAMP、IMPIMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用用K K值表示：值表示：K=K=肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤+尿酸尿酸第七十三页，本课件共有78页CompanyL 大多数鱼死后大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP和和AMPAMP已分解尽，超过已分解尽，超过24h24h，鲜度主要取决于鲜度主要取决于IMP-IMP-肌苷肌苷-次黄嘌呤次黄嘌呤-尿酸。尿酸。将这三个步骤
30、的三种酶（将这三个步骤的三种酶（55核苷酸酶、核苷磷酸化酶、核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。v 当当K K2020时，鱼极新鲜，可供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。v K K在在20204040之间为新鲜，必须熟食。之间为新鲜，必须熟食。v K K大于大于4040，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。第七十四页，本课件共有78页CompanyL肉鲜度传感器v肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。类测
31、定能反映肉类的新鲜程度。v用用腐胺氧化酶腐胺氧化酶与与过氧化氢电极过氧化氢电极构成多胺生构成多胺生物传感器，或用物传感器，或用单胺氧化酶膜单胺氧化酶膜和和氧电极氧电极组组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。第七十五页，本课件共有78页CompanyL污染微生物及病原菌的检测v1通通过过免免疫疫学学方方法法，即即获获得得相相应应的的特特异异性性抗原和抗体进行分析和检测。抗原和抗体进行分析和检测。第七十六页，本课件共有78页CompanyL(1)(1)将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原成酶标抗体（或酶标抗原 ）；）；(2)(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶抗体抗原复合物。异性地结合在一起，形成酶抗体抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。2.2.酶联免疫测定酶联免疫测定 第七十七页，本课件共有78页感谢大家观看第七十八页，本课件共有78页