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1、1基因治疗基因治疗 敖明章敖明章华中科技大学华中科技大学生命科学与技术学院生命科学与技术学院2023/3/22023/3/22狭义概念狭义概念将将具具有有正正常常功功能能的的基基因因置置换换或或增增补补患患者者体体内内有有缺缺陷陷的的基基因因，从而达到治疗疾病的目的。从而达到治疗疾病的目的。一、基因治疗（一、基因治疗（Gene therapy）概念）概念广义概念广义概念将将某某种种遗遗传传物物质质转转移移到到患患者者细细胞胞内内，使使其其在在体体内内发发挥挥作作用用，最终达到治疗疾病的目的。最终达到治疗疾病的目的。2023/3/234基因治疗分类基因治疗分类体细胞(somatic cell)s
2、omatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)germline)基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代2023/3/25 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略The Strategy of Gene Therapy2023/3/26 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacementgene replacement）定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。的缺陷基因。目的目
3、的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。2023/3/27n又称为基因打靶(gene targeting）n定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术基因同源重组技术2023/3/28n要要实实现现基基因因置置换换，需需要要采采用用同同源源重重组组技技术术使使相相应应的的正正常常基基因因定定向向导导入入受受体
4、体细细胞胞的基因缺陷部位。的基因缺陷部位。n定定向向导导入入的的发发生生率率约约1/1001/100万万，采采用用胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养的的方方法法，这这种种同同源源重重组组的的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。2023/3/29（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增补基因添加或称基因增补（gene augmentationgene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因。类型类型:n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺
5、缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利利用其表达产物达到治疗疾病的目的。用其表达产物达到治疗疾病的目的。2023/3/210（三）基因干预（三）基因干预n基因干预基因干预（gene interferencegene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。达，以达到治疗疾病
6、的目的。2023/3/211（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗n自自杀杀基基因因治治疗疗:恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要要方法之一。方法之一。n原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细胞的目的。细胞的目的。2023/3/212自杀基因的作用机制 2023/3/213TK/GCVTK/GCV 单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒（herps herps simplex sim
7、plex virus,virus,HSVHSV）型型胸胸苷苷激激酶酶（thymidine thymidine kinase,kinase,tktk）基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶，特特异异性性地地将将无无毒毒的的核核苷苷类类似似物物丙丙氧氧鸟鸟苷苷（ganciclovir,ganciclovir,GCVGCV）转转变变成成毒毒性性GCVGCV三三磷磷酸酸核核苷苷，后后者能抑制者能抑制DNADNA聚合酶活性，导致细胞死亡。聚合酶活性，导致细胞死亡。CD/5-FCCD/5-FC 大大肠肠杆杆菌菌胞胞嘧嘧啶啶脱脱氨氨酶酶（cytosine cytosine deaminase,deaminase,
8、CDCD）基基因因，在在细细胞胞内内将将无无毒毒性性5-5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶（5-5-FCFC）转变成毒性产物转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-5-FUFU）。）。1.1.自杀基因系统自杀基因系统2023/3/214 旁旁观观者者效效应应:“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞也被杀死。胞也被杀死。2.2.旁观者效应旁观者效应2023/3/215（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免
9、疫增强细胞因子或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。免疫反应。2023/3/216二、基因转移技术二、基因转移技术 The Technique of Gene Transfer2023/3/217基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞2023/3/218 基因转移基因转移(gene transfer)gene transfer)技术：技术：1.1.病毒介导的基因转移系统。病毒介导的基因转移系统。2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。2023/3/21
10、9 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体是逆转录病毒载体。2023/3/220Retrovirus （1 1）逆转录病毒）逆转录病毒 2023/3/2212023/3/222（1 1）两端各有一长末端重复序列）两端各有一长末端重复序列LTRLTR。逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前
11、病毒的结构特点 （2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。（3 3）病毒有三个结构基因）病毒有三个结构基因（4 4）55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的序序列列（）及及剪接供体位点剪接供体位点(SD)SD)和剪接受体位点和剪接受体位点(SA)SA)。（5 5）含含有有负负链链DNADNA转转录录的的引引物物结结合合位位点点(PBS)PBS)和和正正链链DNADNA转转录录的引物结合位点的引物结合位点(PPT)PPT)。(1)(1)在在U3U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子；(2)U3(2)U3和和U5U5两两端端分
12、分别别有有病病毒毒整整合合序序列列(IS)IS)；(3)(3)在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号。加尾信号。(1)gag(1)gag基基因因，编编码码核核心心蛋蛋白白和和属属特特异异性性抗原；抗原；(2)pol(2)pol基因，编码逆转录酶；基因，编码逆转录酶；(3)env(3)env基基因因，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。2023/3/2232023/3/224逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成：由两部分组成：(1)(1)逆转录病毒载体逆转录病毒载体 (2)(2)
13、辅助细胞株辅助细胞株(如如PA317PA317)2023/3/225Retroviral packaging system2023/3/226 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白，能够被许编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响的缺失不影响其他部分的活性。其他部分的活性。前病毒可以高效整合至
14、靶细胞基因组中，有利于前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的假病毒颗粒包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。于分离制备。2023/3/227 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 7 kbkb以下的外源基
15、因。以下的外源基因。2023/3/228 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirusadenovirus，AV)AV)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36(36 kb)kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可尚未发现与肿瘤发生
16、有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。2023/3/2292023/3/230腺病毒的优点腺病毒的优点1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 7.5 kbkb外源基因；外源基因；2023/3/231 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点
17、2.2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。4.4.靶向性差。靶向性差。1.1.不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组DNADNA中。分裂增殖快中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。的机会增多，表达时间相对较短。(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。2023/3/232 （
18、3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated virusadenovirus associated virus，AAV)AAV)是是一类单链线状一类单链线状DNADNA缺陷型病毒。其基因组缺陷型病毒。其基因组DNADNA小于小于5 5 kbkb，无包膜，外形为裸露的无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒。面体颗粒。AAVAAV不能独立复不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感
19、染，否则只能建立溶源性则只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染。AAV Virus Particles2023/3/233Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因2023/3/234AAVAAV的特点的特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表达就处于抑基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAVAAV基因表基因表达从而使达从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；产生
20、子代病毒并释放，又感染新的细胞，产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。建立新的潜伏状态。2023/3/235 AAV AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。它对人类无致病性。AAV AAV可以高效可以高效定点整合定点整合至人至人1919号染色体的特定号染色体的特定区域区域1919q13.4q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因活和原癌基因激活的潜在危险性，而
21、且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。2023/3/236 AAVAAV载体的缺陷：载体的缺陷：AAVAAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低。感染效率比逆转录病毒载体低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。2023/3/237 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转
22、移系统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。移至细胞内，并进行表达。2023/3/238 脂质体介导的基因转移示意图2023/3/239（2 2）受体介导转移技术）受
23、体介导转移技术 将将DNADNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，可可使使DNADNA具具有有靶靶向向性性。这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（如如多多聚聚赖赖氨氨酸酸）来来实实现现。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNADNA结结合合，将将DNADNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而将外源而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。2023/3/240
24、受体介导转移技术示意图2023/3/241 （3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够按其的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%
25、40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。的凝血因子等等。2023/3/242 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.1.制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNA重组体的技术较容易；重组体的技术较容易；2.2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了逆
26、转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；转的缺点；4.4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。2023/3/243三、基因干预三、基因干预 Gene Interference2023/3/244基因干预的种类：基因干预的种类：n1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)n2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interfer
27、ence)n3.3.核酶核酶 (ribozyme)2023/3/245 （一）反义（一）反义RNARNA 1.1.反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞，细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建能转录反义）构建能转录反义RNARNA的重组质粒，将的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义质粒转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用
28、。而发挥作用。2023/3/246 反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题专一性转移问题：专一性转移问题：2023/3/2472.2.受体介导反义受体介导反义RNARNA技转移术技转移术 受体介导的受体介导的RNARNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环境之间存是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。酸酶的降解作用。将将脱脱唾唾液液酸酸血血清清类类粘粘蛋蛋白白（ASGPA
29、SGP）与与多多聚聚赖赖氨氨酸酸（PLPL）共共价价连连接接，得得到到ASGP-PLASGP-PL复复合合物物，成成为为运运载载核核酸酸的的工工具具。ASGP-PLASGP-PL反反义义RNARNA复复合合物物可可以以专专一一性性地地被被肝肝细细胞胞表表面面的的ASGPASGP受受体体所所识识别别，并并吞吞噬噬到到肝肝细细胞胞中中，反反义义RNARNA进进入入肝肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。借借助助受受体体介介导导DNADNA转转移移方方法法把把DNADNA换换成成反反义义RNARNA，就就可以实现受体介导的反义可以实现受体介导的反义RNARNA的转移。
30、的转移。2023/3/248 3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，而在基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计和制备方便设计和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反反义义RNARNA只只作作用用于于特特异异的的mRNAmRNA分分子子，不不改改变变所所调调节节基基因因的的结结构构。反反义义RNARNA分分子子无无
31、论论怎怎样样修修饰饰，最最终终将将在在细细胞胞内内部部被被降降解解，不不留留“残渣残渣”。在在治治疗疗RNARNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时，受受体体介介导导的的反反义义RNARNA基基因因治治疗疗比比一一般般的的DNADNA基基因因治治疗疗有有更更大大的的优优势势。利利用用反反义义RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNARNA，阻断阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。2023/3/249（二）干扰（二）干扰RNARNA 实验结果显示，有义链实验结果显示，有义链RNARNA（sense RNAsense RNA）或反义链或反义链RNARNA（antisense RNAa
32、ntisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链均能抑制线虫基因的表达，双链RNARNA比单链比单链RNARNA更为有效。将特异的双链更为有效。将特异的双链RNARNA注入线虫体内注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNARNA和反义链和反义链RNARNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义对反义RNARNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义效率比反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。个数量级。1.RNA1.RNA干扰
33、现象干扰现象 RNA RNA干扰干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAi RNAi）是一种由双链是一种由双链RNARNA诱诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNARNA有同源序列的有同源序列的信使信使RNARNA（mRNAmRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。被降解，从而抑制该基因的表达。对对RNARNA干扰的认识来源于用线虫（干扰的认识来源于用线虫（C.elegansC.elegans）和果和果蝇所进行的实验。蝇所进行的实验。2023/3/250 2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主
34、要有干扰过程主要有2 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性）小干扰性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNARNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced RNA-induced silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与siRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA，并在特异的位点将该并在特异的位点将该mRNAmRNA切断。切断。长双链长双链RNARNA被细胞内的双链
35、被细胞内的双链RNARNA特异性核特异性核酸酶酸酶DicerDicer切成切成21-2321-23个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNA，称为小干扰性称为小干扰性RNARNA（small small interfering RNAinterfering RNA，siRNAsiRNA）。）。2023/3/251 1.1.体外化学合成体外化学合成;2.2.用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体可可在在细细胞胞内稳定地生成内稳定地生成。siRNAsiRNA的产生的产生2023/3/2523.RNA3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNA RNA干扰研究目前已经在功能基因组学干扰研究目前
36、已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。2023/3/253（1 1）研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 由于由于 RNARNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。的研究工具。RNARNA
37、干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的产生类似基因敲除的效应效应。2023/3/254 （2 2）肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗 传传统统反反义义RNARNA技技术术诱诱发发的的单单一一癌癌基基因因的的阻阻断断，不不可可能能完完全全抑抑制制或或逆逆转转肿肿瘤瘤的的生生长长，而而RNARNA干干扰扰技技术术可可以以利利用用同同一一基基因因家家族族的的多多个个基基因因具具有有一一段段同同源源性性很很高高的的保保守守序序
38、列列这这一一特特性性，设设计计针针对对这这一一区区段段序序列列的的双双链链RNARNA分分子子，只只使使用用一一种种双双链链RNARNA即即可可以以产产生生多多个个基基因因同同时时剔剔除除的的表表型型，也也可可以以同同时时使使用用多多种种双双链链RNARNA而而将将多多个个序序列列不不相相关关的的基基因因同同时时剔剔除除。RNARNA干干扰扰技技术术可可用用于于治治疗疗有有异异常常基基因因表表达达的的恶恶性性肿瘤。肿瘤。K-RASK-RAS蛋蛋白白为为肿肿瘤瘤发发生生所所必必需需，bcr/ab1bcr/ab1融融合合基基因因与与人人白白血血病病有有关关，用用RNARNA干干扰扰技技术术可可以以
39、阻阻碍碍K-RASK-RAS蛋蛋白白的的表表达达从从而而抑制肿瘤发生，或杀死有抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1bcr/ab1的人白血病细胞系。的人白血病细胞系。通通过过RNARNA干干扰扰抑抑制制某某些些内内源源性性基基因因的的表表达达，能能促促进进白白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。应应用用RNARNA干干扰扰技技术术成成功功地地阻阻断断了了MCF-7MCF-7乳乳腺腺癌癌细细胞胞中中一一种种异异常常表表达达的的与与细细胞胞增增殖殖分分化化相相关关的的核核转转录录因因子子基基因因Sp1Sp1的功能。的功能。2023/3/25
40、5 （3 3）病毒性疾病的基因治疗病毒性疾病的基因治疗 RNARNA干干扰扰可可以以被被看看成成是是一一种种与与免免疫疫系系统统类类似似的的防防御御机机制制。用用siRNAsiRNA抑抑制制人人类类免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒（HIVHIV）某某些些基基因因的的表表达达，如如P24P24、VifVif、nefnef、tattat或或revrev，阻阻碍碍HIVHIV在在细细胞胞内内复复制制。用用RNARNA干干扰扰技技术术抑抑制制HIVHIV的的受受体体（CD4CD4）或或辅辅助助受受体体（CXCR4CXCR4或或CCR5CCR5）在在细细胞胞内内表表达达，可可阻阻碍碍HIVHIV感感染染细细胞胞
41、。也也可可通通过过RNARNA干干扰扰抑抑制制其其他他病病毒毒在在细细胞胞内内复复制制，如如脊脊髓髓灰灰质质炎炎病病毒毒、人人乳乳头头状状瘤瘤病病毒毒、乙乙型型肝肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。炎病毒和丙型肝炎病毒等。2023/3/256 siRNAsiRNA在病毒感染的在病毒感染的早期阶段早期阶段能有效地抑制病毒的复制能有效地抑制病毒的复制，病毒感，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基染能被针对病毒基因和相关宿主基因的因的siRNAsiRNA所阻断，所阻断，RNARNA干扰技术将干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防这对于许多严重的病毒
42、性疾病的防治具有十分重大的意义。治具有十分重大的意义。2023/3/257（三）核酶（三）核酶(ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个用。但核酶也可以由两个RNARNA分子组成。分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNARNA分子中分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNARNA分子切断，分子切断，通过破坏靶通过破坏靶RNARNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNARNA）的目的。的目的
43、。只要两个只要两个RNARNA分子通过互补序列相结合，形成锤头分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（状的二级结构（3 3个螺旋区），并能组成核酶的核心序个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（列（1313个或个或1111个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。产生剪切反应。2023/3/258 1.核酶的设计核酶的设计 核核酶酶是是通通过过靶靶RNARNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。（1 1）选选择择合合适适的的靶靶部部位位
44、，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点点，能能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2 2）核核酶酶的的基基本本组组成成：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，中中间间是是保保守守序序列列（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构构域），两端是引导序列域），两端是引导序列。在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。2
45、023/3/259核酶的作用机制 2023/3/260 2.2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。2023/3/261四、治疗基因的受控表达四、治疗基因的受控表达 Regulated Expression of Therapeutic Gene2023/3/262 时间时间:要要
46、实实现现治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达，必必须须建建立立完完善善的的基基因因表表达达调调控控体体系系。基基因因调调控控策策略略大大致致有有以以下下几几种种：基基因因内内部部调调节节机机制制、基基因因外外部部调调节节机机制制、利利用用病病灶灶微微环环境境使使治治疗疗基基因因特特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。异性表达以及治疗基因的诱导表达等。治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达包包括括控控制制治治疗疗基基因因表表达达的的时时间间、空间和水平空间和水平三个方面。三个方面。空间空间:表达水平：表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。希望治疗基因能在一个适当的水平表达。1.1.控控制制治
47、治疗疗的的基基因因在在患患者者需需要要实实施施治治疗疗时时才才表表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；2.2.根根据据不不同同疾疾病病的的治治疗疗要要求求，控控制制治治疗疗基基因因持持续表达的时间跨度。续表达的时间跨度。是是指指为为了了提提高高基基因因治治疗疗的的专专一一性性和和安安全全性性，严严格格限限制制治治疗疗基基因因只只在在靶靶细细胞胞中中表表达达，避避免免治治疗疗基基因因指指导导合合成成的的蛋蛋白白质质干干扰扰非非靶靶细细胞胞的的正正常常生生活活，产产生毒副作用。生毒副作用。2023/3/263（一）基因内部的调节机制（一）基因内部的调
48、节机制使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件2023/3/264 1.1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 例例如如，酪酪氨氨酸酸酶酶是是皮皮肤肤细细胞胞和和黑黑色色素素瘤瘤细细胞胞产产生生色色素素途途径径中中的的一一种种酶酶，可可利利用用其其启启动动子子驱驱动动治治疗疗基基因因只只在在黑黑色色素素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。不不同同类类型型的的正正常常细细胞
49、胞或或组组织织中中往往往往存存在在某某些些特特有有的的蛋蛋白白质质，它它们们的的基基因因表表达达调调控控元元件件可可用用于于驱驱动动治治疗疗基基因因的特异性表达，从而起到治疗作用。的特异性表达，从而起到治疗作用。前前列列腺腺特特异异性性抗抗原原(PSA)PSA)是是参参与与精精液液凝凝块块中中蛋蛋白白质质降降解解、使使精精液液液液化化的的一一种种丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶。它它主主要要在在前前列列腺腺中中产产生生，而而在在前前列列腺腺癌癌细细胞胞中中含含量量很很高高，可可以以利利用用PSAPSA基基因因调调控控元元件件驱驱动动治治疗疗基基因因在在PSAPSA阳阳性性的的前前列列腺腺癌癌细细胞胞中
50、中表表达达而而发发挥挥作作用用，而而其其在在PSAPSA阴阴性性细细胞胞和和非非前前列列腺腺癌细胞中不能使治疗基因表达。癌细胞中不能使治疗基因表达。2023/3/265 2.2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 某某些些病病变变的的细细胞胞或或组组织织产产生生一一些些特特殊殊的的蛋蛋白白质质，其其基基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。甲甲胎胎蛋蛋白白(AFP)AFP)基基因因正正常常情情况况下下只只在在胚胚胎胎肝肝细细胞胞中中表表达达，不不在在成成年年肝肝脏脏细细胞胞中中表表达