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1、L/O/G/O关于莨菪烷类抗胆碱药物分析第一页，本课件共有39页学习要求学习要求掌握莨菪烷类药物的鉴别和特殊杂质检查方法原理与应用掌握莨菪烷类药物的鉴别和特殊杂质检查方法原理与应用熟悉含量测定的酸性染料比色法、非水滴定法和熟悉含量测定的酸性染料比色法、非水滴定法和HPLC法法掌握莨菪烷类抗胆碱药物的结构特征、理化性质与分析方法之间的掌握莨菪烷类抗胆碱药物的结构特征、理化性质与分析方法之间的关系关系4123了解其他分析方法在莨菪烷类药物分析中的应用了解其他分析方法在莨菪烷类药物分析中的应用 第二页，本课件共有39页第一节第一节 莨菪烷类药物的结构和性质莨菪烷类药物的结构和性质颠茄生物碱的来源颠茄
2、生物碱的来源：从茄科植物，如颠茄、从茄科植物，如颠茄、莨菪和曼陀罗等中提取的生物碱莨菪和曼陀罗等中提取的生物碱，由莨，由莨菪醇与不同有机酸所成的酯菪醇与不同有机酸所成的酯。作用作用：具有对具有对M受体阻断作用受体阻断作用第三页，本课件共有39页（一）（一）典型药物的结构典型药物的结构 硫酸阿托品硫酸阿托品 氢溴酸东氢溴酸东莨菪碱莨菪碱 （atropine sulfate）(Scopolamine hydrobromide）第一节第一节 莨菪烷类药物的结构和性质莨菪烷类药物的结构和性质第四页，本课件共有39页第一节第一节 莨菪烷类药物的结构和性质莨菪烷类药物的结构和性质氢溴酸山莨菪碱氢溴酸山莨菪
3、碱(Anisodamine hydrobromide）氢溴酸后马托品氢溴酸后马托品(Hormatropine hydrobromide）第五页，本课件共有39页第一节第一节 莨菪烷类药物的结构和性质莨菪烷类药物的结构和性质樟柳碱樟柳碱 (Anisodine）甲溴东莨菪碱甲溴东莨菪碱(Methscopolamin Bromide）第六页，本课件共有39页第一节第一节 莨菪烷类药物的结构和性质莨菪烷类药物的结构和性质（二）主要化学性质（二）主要化学性质1.水解性水解性 阿托品和东莨菪碱分子结构中，阿托品和东莨菪碱分子结构中，具有酯的结构，易水解具有酯的结构，易水解。以阿托品。以阿托品为例，为例，水
4、解水解生成生成莨菪醇莨菪醇()和和莨菪酸莨菪酸()，其反应结构式，其反应结构式:2.碱性碱性 阿托品和东莨菪碱结构中，五原脂环含有阿托品和东莨菪碱结构中，五原脂环含有叔胺氮原子叔胺氮原子，较强的碱性，较强的碱性，易于酸成盐，如阿托品易于酸成盐，如阿托品pKb1为为4.353.旋光性旋光性 氢溴酸东莨菪碱含有不对称碳原子，左旋体比旋度为氢溴酸东莨菪碱含有不对称碳原子，左旋体比旋度为-24至至-27。阿托。阿托品虽然含有不对称碳原子，但外消旋化，无旋光性品虽然含有不对称碳原子，但外消旋化，无旋光性第七页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应鉴别鉴别鉴别鉴别反应反应反应反应12345托烷生
5、物碱的鉴别反应（托烷生物碱的鉴别反应（托烷生物碱的鉴别反应（托烷生物碱的鉴别反应（托烷生物碱的鉴别反应（托烷生物碱的鉴别反应（VitailiVitailiVitaili反应）反应）反应）反应）反应）反应）与硫酸与硫酸与硫酸与硫酸与硫酸与硫酸-重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与生物碱显色剂和沉淀剂的反应 色谱法色谱法色谱法色谱法色谱法色谱法 光谱鉴别法光谱鉴别法光谱鉴别法光谱鉴别法光谱鉴别法光谱鉴别法第八页
6、，本课件共有39页阿托品、莨菪碱等托烷类生物碱水解后生阿托品、莨菪碱等托烷类生物碱水解后生成莨菪酸，均可发生成莨菪酸，均可发生Vitaili反应反应 生成具有生成具有共轭结构共轭结构的阴离子而显的阴离子而显深紫色深紫色 与发烟硝酸共热，得到黄色三硝基衍与发烟硝酸共热，得到黄色三硝基衍生物，放冷，加醇制氢氧化钾少许，生物，放冷，加醇制氢氧化钾少许，即即脱羧脱羧 一、托烷生物碱的鉴别反应（一、托烷生物碱的鉴别反应（Vitaili反应）反应）第二节第二节 鉴别反应鉴别反应第九页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应例例1 氢溴酸山莨菪碱的鉴别氢溴酸山莨菪碱的鉴别氢溴酸山莨菪碱的鉴别氢溴酸山
7、莨菪碱的鉴别 取本品约取本品约取本品约取本品约10mg10mg，加发烟硝酸，加发烟硝酸，加发烟硝酸，加发烟硝酸5 5滴，置水滴，置水滴，置水滴，置水浴上蒸干，得黄色残渣，放冷，加乙醇浴上蒸干，得黄色残渣，放冷，加乙醇浴上蒸干，得黄色残渣，放冷，加乙醇浴上蒸干，得黄色残渣，放冷，加乙醇2323滴湿润，加固体氢氧化滴湿润，加固体氢氧化滴湿润，加固体氢氧化滴湿润，加固体氢氧化钾一小粒，即显深紫色。钾一小粒，即显深紫色。钾一小粒，即显深紫色。钾一小粒，即显深紫色。第十页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应二、与硫酸二、与硫酸-重铬酸钾的反应重铬酸钾的反应三三、与生物碱显色剂和沉淀剂的反应与
8、生物碱显色剂和沉淀剂的反应 阿托品氯化汞醇试液阿托品氯化汞醇试液黄色沉淀黄色沉淀东莨菪碱氯化汞醇东莨菪碱氯化汞醇白色复盐沉淀白色复盐沉淀第十一页，本课件共有39页氢溴酸东莨氢溴酸东莨菪碱的鉴别菪碱的鉴别即生成白色沉淀（与阿托即生成白色沉淀（与阿托品及后马托品的区别）品及后马托品的区别）取本品约取本品约10mg，加水，加水1ml溶解后，置分液漏斗溶解后，置分液漏斗中中分取三氯甲烷液，置水分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣中加二浴上蒸干，残渣中加二氯化汞的乙醇溶液氯化汞的乙醇溶液1.5ml 加氨试液使成碱性后，加氨试液使成碱性后，加三氯甲烷加三氯甲烷5ml，摇匀，摇匀 第二节第二节 鉴别反应（例鉴
9、别反应（例2）第十二页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应生物碱沉淀试剂生物碱沉淀试剂反应条件及结果反应条件及结果碘化铋钾试液（碘化铋钾试液（Dragendorff试剂）试剂）橙红或棕红色沉淀橙红或棕红色沉淀碘化钾碘试液碘化钾碘试液(Wagnen试剂试剂)棕色或棕褐色沉淀棕色或棕褐色沉淀碘化汞钾试液碘化汞钾试液(Mayen试剂试剂)在酸性或碱性溶剂中生成白色或淡黄在酸性或碱性溶剂中生成白色或淡黄色沉淀色沉淀三硝基苯酚试液（三硝基苯酚试液（Hager试剂或苦味酸试剂或苦味酸试液）试液）结晶性沉淀并有特定熔点结晶性沉淀并有特定熔点硅钨酸试液（硅钨酸试液（Bertrend试剂）试剂）白色
10、、淡黄色或黄棕色沉淀白色、淡黄色或黄棕色沉淀磷钨酸试液（磷钨酸试液（Scheibler试剂）试剂）酸性或中性溶液中，淡黄色沉淀酸性或中性溶液中，淡黄色沉淀表表13-2 常用的生物碱沉淀试剂及反应常用的生物碱沉淀试剂及反应Tab.13-2 The precipitation reagents and reaction for testing alkaloids 第十三页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应四、光谱鉴别法四、光谱鉴别法通过比较max、min或吸收光谱的一致性进行鉴别，也可比较其吸光度或吸收系数的比值来鉴别绝大多数生物碱原料药都采用IR法鉴别 UVUV IRIR第十四页，
11、本课件共有39页四、光谱鉴别法四、光谱鉴别法氢溴酸东莨菪氢溴酸东莨菪红外光谱红外光谱The infrared spectrum of Scopolamine Hydrobromide 第二节第二节 鉴别反应鉴别反应第十五页，本课件共有39页第二节第二节 鉴别反应鉴别反应c c色谱法一般用于已知生物碱的鉴别色谱法一般用于已知生物碱的鉴别色谱法一般用于已知生物碱的鉴别色谱法一般用于已知生物碱的鉴别TLCTLCHPLCHPLCGCGCPCPC五、色谱法五、色谱法第十六页，本课件共有39页例例4 Ch.P氢溴酸山莨菪碱注射液氢溴酸山莨菪碱注射液TLC鉴别鉴别 取本品取本品1ml，置水浴上蒸干。取残渣与
12、消旋山莨菪碱对照品，分置水浴上蒸干。取残渣与消旋山莨菪碱对照品，分别加甲醇制成别加甲醇制成10mg/ml的溶液。照薄层色谱法试验，的溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各吸取上述两种溶液各10l，分别点于同一氧化铝（中性，分别点于同一氧化铝（中性，活度活度-级）薄层板上，以三氯甲烷级）薄层板上，以三氯甲烷-无水乙醇（无水乙醇（95 5）为展开剂，展开，晾干，喷以稀碘化铋钾试液）为展开剂，展开，晾干，喷以稀碘化铋钾试液-碘化碘化钾碘试液（钾碘试液（1 1）。供试品溶液所显主斑点位置和颜）。供试品溶液所显主斑点位置和颜色，应与对照品溶液的主斑点相同。色，应与对照品溶液的主斑点相同。第二节第二节
13、 鉴别反应鉴别反应第十七页，本课件共有39页第三节第三节 特殊杂质与检查特殊杂质与检查氢溴酸东莨菪碱中特殊杂质检查氢溴酸东莨菪碱中特殊杂质检查氢溴酸东莨菪碱氢溴酸东莨菪碱来源来源：茄科植物颠茄、白曼陀罗、莨菪中等提取茄科植物颠茄、白曼陀罗、莨菪中等提取（我国，白曼陀罗的干燥品：洋金花中提取东莨菪碱，制成氢溴酸盐）（我国，白曼陀罗的干燥品：洋金花中提取东莨菪碱，制成氢溴酸盐）制备方法制备方法：洋金花粗粉洋金花粗粉乙醇乙醇/渗漉渗漉渗漉液渗漉液减压蒸馏减压蒸馏浸膏浸膏H2SO4/提取提取酸性提取液酸性提取液Na2CO3,CHCl3/提取提取总生物碱总生物碱Na2CO3,CHCl3/分离分离东莨菪碱
14、东莨菪碱HBr/成盐成盐氢溴酸东莨菪碱（粗品）氢溴酸东莨菪碱（粗品）75%C2H5OH/精制精制成品成品第十八页，本课件共有39页第三节第三节 特殊杂质与检查特殊杂质与检查特殊杂质与检查特殊杂质与检查取本品0.50g，加水10ml溶解后，依法测定（附录 H），pH值应为4.05.5。强酸弱碱强酸弱碱取本品0.15g,加水5ml溶解后，在1520加高锰酸钾滴定液(0.02mol/L)0.05ml，10分钟内红色不得完全消失。阿扑东莨阿扑东莨菪碱、其他含有不饱和双键的有机菪碱、其他含有不饱和双键的有机物质物质取本品0.10g，加水2ml 溶解后，分成两等份：一份中加氨试液23滴，不得发生浑浊；另一
15、份中加氢氧化钾试液数滴，只许发生瞬即消失的类白色浑浊。阿扑阿托品、颠茄碱阿扑阿托品、颠茄碱 酸度易氧化物其他生物碱第十九页，本课件共有39页一、酸性染料比色法的基本原理一、酸性染料比色法的基本原理UV 第四节第四节 含量测定含量测定第二十页，本课件共有39页应用示例硫酸阿托品片的含量测定精密量取对照品溶液和供试品溶液各精密量取对照品溶液和供试品溶液各2ml2ml，分别置预先精密加入，分别置预先精密加入三氯甲烷三氯甲烷10ml10ml的分液漏斗中，各加的分液漏斗中，各加溴甲酚绿溴甲酚绿溶液溶液4ml4ml，振摇提，振摇提取后，静置使分层；分取三氯甲烷液，照紫外取后，静置使分层；分取三氯甲烷液，照
16、紫外-可见分光光度法，可见分光光度法，在在420nm420nm波长处分别测定吸光度，计算，即得。波长处分别测定吸光度，计算，即得。第四节第四节 含量测定含量测定第二十一页，本课件共有39页第四节第四节 含量测定含量测定BBE EC CDDAA有机试剂有机试剂有机试剂有机试剂的选择的选择的选择的选择水分水分水分水分的影响的影响的影响的影响水相最佳水相最佳水相最佳水相最佳pHpH值值值值的选择的选择的选择的选择酸性染料酸性染料酸性染料酸性染料的选择及的选择及的选择及的选择及其其其其浓度浓度浓度浓度酸性染料中酸性染料中酸性染料中酸性染料中杂质杂质杂质杂质的影响的影响的影响的影响酸性染料比酸性染料比酸
17、性染料比酸性染料比色法的影响色法的影响色法的影响色法的影响因素因素因素因素第二十二页，本课件共有39页u 水性最佳pH值：使得使得BHBH+和和InIn-最多最多u 酸性染料及其浓度：定量结合；对离子对的溶解性定量结合；对离子对的溶解性好；有较高的吸收度；足够量即可好；有较高的吸收度；足够量即可u 有机溶剂的选择：提取效率高，氯仿最理想提取效率高，氯仿最理想u 水分的影响：影响结果，脱水剂或滤纸除去水分影响结果，脱水剂或滤纸除去水分u 酸性染料中的有色杂质：有机溶剂萃取除去有机溶剂萃取除去第四节第四节 含量测定含量测定第二十三页，本课件共有39页第四节第四节 含量测定含量测定测定法测定法 精密
18、量取对照品溶液和供试品溶液各2ml，分别置预先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚绿2.0ml，振摇提取两分钟后，静止分层，分取澄清的三氯甲烷液，在420nm波长处分别测定吸光度，计算，并将结果与1.027相乘，即得本品（C17H23NO3）2H2SO4H2O相当标示量的百分含量。百分标示量式中Ax、AS分别为供试品和对照品溶液的吸光度；CS为对照品溶液的浓度mg/ml；m为样品质量；为平均片重。1.027为（C17H23NO3）2H2SO4H2O与（C17H23NO3）2H2SO4H2O的质量换算系数。第二十四页，本课件共有39页Fig.13-2 The UV-spectrum
19、of atropine sulfate with BTB ions1.离子对 2.染料空白（对照品平行测定，空白吸收可被扣除）3.阿托品（水溶液在420nm附近无吸收）第四节第四节 含量测定含量测定第二十五页，本课件共有39页一、非水溶液滴定法当当HA酸性较强时，反应不能定量完成，必须除去或降低酸性较强时，反应不能定量完成，必须除去或降低HA的酸性，的酸性，使反应顺利地完成。使反应顺利地完成。BH+A-+HClO4BH+ClO4+HA游离碱类盐游离碱类盐被置换出的弱酸被置换出的弱酸第四节第四节 含量测定含量测定第二十六页，本课件共有39页供供试试品品+冰冰醋醋酸酸10ml30ml若供试品为氢卤
20、酸盐再若供试品为氢卤酸盐再加加5%醋酸汞的冰醋酸液醋酸汞的冰醋酸液3ml5ml结结果果HClO4滴定滴定空白试验空白试验校正校正指示剂碱性溶液碱性溶液pKpKb b1010，冰醋酸中滴定，冰醋酸中滴定突跃不明显，需加入醋酐，使突跃不明显，需加入醋酐，使碱性增强，突跃更明显碱性增强，突跃更明显第四节第四节 含量测定含量测定第二十七页，本课件共有39页适用范围广适用范围广 分离模式多样分离模式多样 检测手段多样灵敏检测手段多样灵敏 选择和专属性强选择和专属性强 分离速度快分离速度快重复性好重复性好 HPLC优点优点各国药典中采用各国药典中采用HPLC法对莨菪类生物碱的含量和有关物法对莨菪类生物碱的
21、含量和有关物质进行直接分析测定的比例不断增加。质进行直接分析测定的比例不断增加。第四节第四节 含量测定含量测定第二十八页，本课件共有39页色谱保留常常较色谱保留常常较弱，从而影响到弱，从而影响到它们的含量或有它们的含量或有关物质关物质HPLCHPLC测定测定的专属性和准确的专属性和准确度。度。采用离子对采用离子对高效液相色高效液相色谱法，可以谱法，可以改善它们的改善它们的色谱保留行色谱保留行为，并实现为，并实现准确测定。准确测定。在反相液相色谱条件下呈离子状态的药物，如有机碱类、有机酸类在反相液相色谱条件下呈离子状态的药物，如有机碱类、有机酸类等等调整流动相的调整流动相的pHpH，抑制它们，抑
22、制它们的解离，以改的解离，以改变色谱保留行变色谱保留行为。但并不都为。但并不都能获得满意的能获得满意的结果。结果。第四节第四节 含量测定含量测定第二十九页，本课件共有39页了解药物在了解药物在体内数量与体内数量与质量的变化质量的变化 获得药代参数和获得药代参数和药物转化、代谢药物转化、代谢的方式、途径等的方式、途径等信息信息有助于对所有助于对所研究的药物研究的药物作出综合评作出综合评价价 概念：研究生物机体中药物及其概念：研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的代谢物和内源性物质的质与量变化质与量变化规律规律的分析方法学的分析方法学 体内药体内药物分析物分析通过分通过分析手段析手段第五节第五
23、节 体内药物分析体内药物分析 第三十页，本课件共有39页去除蛋白质去除蛋白质 缀合物的水解缀合物的水解 液液-液提取液提取 固相提取固相提取 化学衍生化化学衍生化 12345生物样品组成复杂，干扰杂质多，一般需经分离、纯化，生物样品组成复杂，干扰杂质多，一般需经分离、纯化，排除干扰后才能进行测定排除干扰后才能进行测定 第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 第三十一页，本课件共有39页有些药物的生物样品即使经预处理有些药物的生物样品即使经预处理和富集，采用和富集，采用HPLC-UV测定时仍测定时仍有干扰；而且对于小剂量或生物利有干扰；而且对于小剂量或生物利用度低的药物，采用用度低的药物，采用U
24、VUV检测、甚至检测、甚至荧光检测时，灵敏度也不能满足要荧光检测时，灵敏度也不能满足要求求 现代色谱和光谱的联用技术集色现代色谱和光谱的联用技术集色谱的高分离效能和光谱的高专属谱的高分离效能和光谱的高专属性与高灵敏度于一体，尤其是液性与高灵敏度于一体，尤其是液相色谱相色谱-串联质谱法串联质谱法(LC-MS/MS)，对于绝大多数有机碱性药物的，对于绝大多数有机碱性药物的检测限能达检测限能达10pg/ml。存在问题存在问题解决办法解决办法第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 第三十二页，本课件共有39页复杂生物样品中微量药复杂生物样品中微量药物定量测定专属有物定量测定专属有效的方法效的方法集色谱
25、的集色谱的高分离效高分离效能能和光谱的和光谱的高专属高专属性与高灵敏度性与高灵敏度于一于一体体 特点特点作用作用药物代谢物定性鉴定药物代谢物定性鉴定和含量测定常用的方法和含量测定常用的方法 第五节第五节 体内药物分析体内药物分析第三十三页，本课件共有39页第五节第五节 体内药物分析体内药物分析人血浆和皮下脂肪组人血浆和皮下脂肪组织中东莨菪碱的测定织中东莨菪碱的测定介绍莨菪烷类药物的介绍莨菪烷类药物的液液-质联用测定法质联用测定法 介绍生物样品在体介绍生物样品在体取样的微透析技术取样的微透析技术 例实验步骤如下实验步骤如下第三十四页，本课件共有39页第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 FIR
26、STSECONDTHIRDFOURTH受试者静脉滴注氢溴酸东莨菪碱受试者静脉滴注氢溴酸东莨菪碱 15min后分不同时间点取血后分不同时间点取血 精密量取精密量取0.2ml血浆并加入内标血浆并加入内标加入蛋白沉淀剂并调节加入蛋白沉淀剂并调节pH值值 FIFTH涡旋混匀后通过固相萃取涡旋混匀后通过固相萃取 SIXTH进样进样血浆中东莨血浆中东莨菪碱的测定菪碱的测定第三十五页，本课件共有39页第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 皮下脂肪中东皮下脂肪中东莨菪碱的测定莨菪碱的测定微透析探针包埋在皮下脂肪组织的间隙内，微透析探针包埋在皮下脂肪组织的间隙内，每间隔每间隔2020分钟获取一次微透析样品分钟获取一次微透析样品 微透析设备微透析设备探针探针第三十六页，本课件共有39页High-performance liquid chromatography-Mass spectrometry HPLC/MS单级质谱单级质谱HPLC-tandem Mass spectrometry HPLC-MS/MS多级质谱多级质谱第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 第三十七页，本课件共有39页第五节第五节 体内药物分析体内药物分析 第三十八页，本课件共有39页感感谢谢大大家家观观看看第三十九页，本课件共有39页