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1、关于细胞凋亡与细胞衰老第一页，本课件共有42页第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡 单细胞生物而言，细胞死亡既是个体死单细胞生物而言，细胞死亡既是个体死亡。多细胞生物细胞死亡并非意味着个体亡。多细胞生物细胞死亡并非意味着个体死亡。相反在多细胞生物发育中，必须通死亡。相反在多细胞生物发育中，必须通过细胞死亡进行形态建成。正常的组织中过细胞死亡进行形态建成。正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。态所必需的。第二页，本课件共有42页l温和式：温和式：细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）、）、细胞自噬细胞自噬（autophagy）。）。
2、l激烈式：激烈式：细胞坏死细胞坏死（necrosis）（一）细胞坏死（一）细胞坏死 概念概念细胞受到环境因素的严重伤害，如极端的细胞受到环境因素的严重伤害，如极端的物理化学因素和眼中的病理性刺激引起细胞死亡的物理化学因素和眼中的病理性刺激引起细胞死亡的现象。现象。坏死原因坏死原因蛋白变性，蛋白变性，DNA严重损伤，严重损伤，ATP缺缺乏，溶酶体破裂等。乏，溶酶体破裂等。细胞死亡的方式细胞死亡的方式第三页，本课件共有42页u细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。u随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色。u细胞膜不完
3、整，台盼蓝染色阳性(活细胞不着色)。uDNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症。第四页，本课件共有42页通过形成自噬泡与胞内溶酶体融合，消化细胞通过形成自噬泡与胞内溶酶体融合，消化细胞自身结构，自噬一般是细胞维持存活的手段，自身结构，自噬一般是细胞维持存活的手段，但过多自噬导致细胞死亡。但过多自噬导致细胞死亡。细胞自噬是正常的生理过程。也发生在细胞营细胞自噬是正常的生理过程。也发生在细胞营养匮乏及个体发育过程中，如昆虫变态。养匮乏及个体发育过程中，如昆虫变态。细胞自噬可能与细胞凋亡一样在动物发育过程细胞自噬可能与细胞凋亡一样在动物发育过程中形态建成中扮演重要角色。是由细胞自身基中形态建成中扮演
4、重要角色。是由细胞自身基因控制的程序性死亡。因控制的程序性死亡。（二）细胞自噬（二）细胞自噬第五页，本课件共有42页（三）细胞凋亡（三）细胞凋亡细胞凋亡是多细胞生物正常的过程，细胞凋亡是多细胞生物正常的过程，是一种由基因控制的主动的细胞生理是一种由基因控制的主动的细胞生理性自杀行为。性自杀行为。第六页，本课件共有42页 第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）程序性细胞死亡程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)(programmed cell death,PCD)指在生长发育过程中细胞在基因调控下，按照一定时
5、空顺序发生的生理性死亡。细胞凋亡是形态学的概念，程序性细胞死亡是功能上的概念。第七页，本课件共有42页一、动物细胞的程序性细胞死亡一、动物细胞的程序性细胞死亡（一）细胞凋亡（一）细胞凋亡（apoptosisapoptosis）1 1 动物细胞凋亡形态特征动物细胞凋亡形态特征1)1)凋亡的起始凋亡的起始细胞膜：完整，表面特化结构消失，细胞间接触消失细胞膜：完整，表面特化结构消失，细胞间接触消失细胞质：线粒体形态变化不大，核糖体从内质网解离，细胞质：线粒体形态变化不大，核糖体从内质网解离，内质网膨胀，溶酶体活性不增加。内质网膨胀，溶酶体活性不增加。细胞核：染色质靠边、固缩，细胞核变型突出，染色细胞
6、核：染色质靠边、固缩，细胞核变型突出，染色质断裂。质断裂。2 2）凋亡小体的形成）凋亡小体的形成整个细胞：通过出芽（发泡）的方式形成许多凋亡小体，凋整个细胞：通过出芽（发泡）的方式形成许多凋亡小体，凋亡小体内有结构完整的细胞器；亡小体内有结构完整的细胞器；3 3）凋亡小体被临近细胞或体内吞噬细胞吞噬消化）凋亡小体被临近细胞或体内吞噬细胞吞噬消化第八页，本课件共有42页2 2 凋亡的生化特征凋亡的生化特征 无细胞质外泄，不引起炎症反应；核酸内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状；tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平；质膜PS（磷酯酰丝氨酸，phosphatidylserine)
7、外翻。凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。第九页，本课件共有42页坏坏死死凋凋亡亡第十页，本课件共有42页第十一页，本课件共有42页第十二页，本课件共有42页第十三页，本课件共有42页1.1.形态学，电镜，光镜；形态学，电镜，光镜；2.DNA2.DNA凝胶电泳凝胶电泳ladderladder；3.3.流式细胞计；流式细胞计；4.4.核酸内切酶活力检测；核酸内切酶活力检测；5.5.彗星电泳法；彗星电泳法；6.Annexin V6.Annexin V检测细胞膜外表面检测细胞膜外表面PSPS；7.TUNEL7.TUNEL技术（末端脱氧核苷酸转移酶标记法）。
8、技术（末端脱氧核苷酸转移酶标记法）。3 3 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法第十四页，本课件共有42页常用检测细胞凋亡的染料：常用检测细胞凋亡的染料：l二乙酸荧光素（二乙酸荧光素（FDAFDA），绿色荧光，活细胞染色。），绿色荧光，活细胞染色。lHoechst 33342Hoechst 33342或或3325833258，DAPIDAPI，吖啶橙（，吖啶橙（AOAO），半），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。l溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）、碘化丙啶（）、碘化丙啶（PIPI）、放线菌素）、放线菌素D D（7AAD7AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。）
9、，不通透，正常和凋亡细胞拒染。l各种碱性染料。固定后染细胞核。各种碱性染料。固定后染细胞核。l可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。第十五页，本课件共有42页A：人类白血病T细胞经1微升喜树碱处理，早期凋亡特异性的特征被荧光标记的Annexin5(Ca2+依赖性磷脂结合蛋白)检测到(产生凋亡小体的黄色绿色细胞)。晚期凋亡和坏死细胞被pi染色（橙红色细胞核）。细胞凋亡的发生伴有细胞膜磷脂酰丝氨酸移位酶的激活，提示细胞膜膜脂双层的某些成分由胞浆面向细胞质面外翻，可能是细胞凋亡的早期征象。B：人白血病细胞株HL-60 cells（急性粒细胞白血病，p53缺陷
10、）被喜树碱诱导3小时。DNA段端被荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶标记。AB第十六页，本课件共有42页（1 1）生理学意义）生理学意义 确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）；价值的细胞（指趾间组织细胞）；维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞；应细胞，衰老细胞；发挥积极的防御功能：感染病毒细胞凋亡，阻发挥积极的防御功能：感染病毒细胞凋亡，阻止病毒复制止病毒复制。4 4 细胞凋亡的生理和病理学意义细胞凋亡的生理和病理学意义第十七页，本课件共有42页发育中的小鼠趾间细胞凋
11、亡发育中的小鼠趾间细胞凋亡第十八页，本课件共有42页神经细胞与靶细胞联系建立的过程中多余的神经细胞凋亡神经细胞与靶细胞联系建立的过程中多余的神经细胞凋亡第十九页，本课件共有42页（2 2）病理学意义）病理学意义病原体侵染；病原体侵染；诱导凋亡HIV 抑制凋亡天花病毒细胞凋亡不足细胞凋亡不足 肿瘤，自身免疫疾病；细胞凋亡过度细胞凋亡过度 神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。第二十页，本课件共有42页（二）细胞凋亡的分子机制（二）细胞凋亡的分子机制1 1 诱发凋亡的因素诱发凋亡的因素 细胞之所以凋亡是因为细胞受到温和胁迫、衰老、其他细胞的刺激或者细胞接受不到外界
12、生长存活信号。诱导凋亡的因素分两大类：物理因素物理因素：射线、温和的热激、冷激、渗透胁迫。化学因素化学因素：活性氧、钙离子、视黄醛、细胞毒素、凋亡细胞因子等。细胞接受死亡信号后主要通过两种途径实现细胞凋亡u蛋白酶蛋白酶CaspaseCaspase依赖型细胞凋亡依赖型细胞凋亡：激活的Caspase切割靶蛋白导致细胞凋亡；u非非CaspaseCaspase依赖型细胞凋亡依赖型细胞凋亡：可同时激活。第二十一页，本课件共有42页2 Caspase2 Caspase依赖性细胞凋亡依赖性细胞凋亡Caspase的发现和秀丽隐杆线虫程序性细胞死亡研究有的发现和秀丽隐杆线虫程序性细胞死亡研究有关。关。u秀丽隐杆
13、线虫是研究PCD的理想材料（1mm长，透明，3.5天即可有合子发育成熟，细胞总共产生1090个细胞，其中131个凋亡）。u控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9等。u哺乳动物中线虫相关基因（蛋白）研究发现10多种Caspase。Ced-3和Ced-4诱发凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。u其中Caspase1与线虫Ced-3同源。负责白介素活化，调节免疫，亦有促使细胞凋亡功能。第二十二页，本课件共有42页植物气孔植物气孔CaspaseCaspase的性质的性质CaspaseCaspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）是存在于
14、细是存在于细胞质中结构类似的一类蛋白酶，具有有限切割靶蛋白的功胞质中结构类似的一类蛋白酶，具有有限切割靶蛋白的功能，切割位点在靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。能，切割位点在靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase Caspase 激活激活自身切割或其他Caspase切割，产生两段肽段形成有蛋白酶活性的二聚体。CaspaseCaspase家族家族可分为起始起始CaspaseCaspase、执行执行CaspaseCaspase和炎症炎症反应介导因子反应介导因子。结构：起始Caspase多含有死亡效应结构域（DED）或Caspase募集结构域（CARD)。起始起始CaspaseCaspase负责接受死
15、亡信号，激活执行Caspase。同性活化。执行执行CaspaseCaspase激活后切割靶蛋白，引起凋亡效应。异性活化。第二十三页，本课件共有42页同性活化（同性活化（homoactivation)homoactivation)即酶原分子聚集成复合物达到一定浓度时，就彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。起始Caspase中，Caspase8和10具有死亡效应结构域，而Caspase2和9具有募集结构域，通过结构域之间的聚合，Caspase能够彼此结合或与接头蛋白（adaptor）结合，被招募到上游信号复合物中发生同性活化。异性活化（异性活化（heteroactivationhetero
16、activation）即起始Caspase招募执行Caspase酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase，切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞死亡。第二十四页，本课件共有42页 Caspase 家族家族第二十五页，本课件共有42页Caspase活化活化Caspase在正常的状态下，它们以无活性的原酶在正常的状态下，它们以无活性的原酶（proenzymes）形式存在。）形式存在。Caspase被同一被同一Caspase特异性的在两个亚基连接特异性的在两个亚基连接处的天冬氨酸位点剪切，同时释放处的天冬氨酸位点剪切，同时释放N-端结构域后端结构域后被激活。激活的上游的被激活。激
17、活的上游的Caspase能依次地激活其能依次地激活其它下游的它下游的Caspase，形成，形成Caspase级联反应，将级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物。凋亡信号一级级传至凋亡底物。第二十六页，本课件共有42页死亡受体起始的外源途径死亡受体起始的外源途径死亡信号来自细胞外促调亡细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）等与细胞表面死亡受体（TNF-R、Fas）的结合。线粒体起始的内源途径线粒体起始的内源途径细胞内部或外部死亡信号导致细胞色素细胞色素c从线粒体游离出来进入细胞质，触发内源凋亡途径。3 Caspas依赖性细胞凋亡的外源途径和依赖性细胞凋亡的外源途径和内源途径内源途径第二十七页，本课件共
18、有42页死亡受体死亡受体介导的细胞凋亡起始于死亡配体与受体的结合。死亡配体死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。TNF是一种具有多种生物学效应的细胞因子，能够使肿瘤组织出血坏死。死亡配体的生物学功能是通过与细胞表面的受体结合来实现的，TNFR1和Fas是死亡受体家族的典型代表。死亡受体起始的外源途径死亡受体起始的外源途径Fas又称作又称作APO-1，属，属TNF受体家族。受体家族。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合激活Caspase。第二十八页，本课件共有42页FasFas诱导
19、的细胞凋亡外源途径诱导的细胞凋亡外源途径（细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡通路）（细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡通路）死亡信号（肿瘤坏死因子）与死亡受体结合（TNF的受体Fas）三聚化；死亡受体结合胞内的DD区（Death domain）与接头蛋白FADD的DD区结合 FADD N端通过DED区（death effector domain）与原Caspase-8蛋白结合，促进Caspase-8 聚集形成死亡信号诱导复合体。Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3、Caspase-7；Caspase-3激活Caspase-6。Caspase切割降解关键性蛋白，包括结构蛋白、蛋白激酶、转
20、录调控蛋白和周期蛋白、核纤层蛋白等等）。Caspase还可降解Dnase 的抑制蛋白，释放Dnase，降解DNA。细胞凋亡第二十九页，本课件共有42页 信号激发活化了Bax凋亡基因，凋亡基因与抗凋亡基因BCL-2结合抑制了抗凋亡基因的作用，引起线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC）打开，细胞色素C被释放到胞质中；释放的细胞色素C与Apaf-1（凋亡蛋白酶激活因子,是线虫Ced-4基因哺乳细胞中的同源物）结合激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3、6等，引起细胞凋亡。线粒体起始的内源途径：线粒体起始的内源途径：（线粒体为核心的细胞凋亡通路）（线粒体为核心的细胞凋亡通路）第三十页，本
21、课件共有42页第三十一页，本课件共有42页含有1-4个Bcl-2同源结构域（Bcl-2 homology）（BH1-4）。分两类：抗凋亡蛋白抗凋亡蛋白（anti-apoptotic protein)和促凋亡蛋白促凋亡蛋白（pro-apoptotic protein)。促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变，导致cyt c释放，引起凋亡。Bcl-2相当于线虫的ced9。主要定位于线粒体膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2基因家族（基因家族（B-cell lymphoma gene 2 family)第三十二页，本课件共有42页凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic pro
22、teaseactivating factor-1，Apaf-1）：线虫的同源物为ced-4。作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1与cyt c、ATP/dATP结合后，召集caspase-9，形成凋亡复合体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。第三十三页，本课件共有42页途径：途径：（1）细胞接受调亡信号后，Bax,Bak形成二聚体从细胞质移到线粒体外膜，打开一种阴离子通道，细胞色素C从线粒体进入细胞质。（2）细胞色素C与Apaf-1结合，使Apaf-1聚合并通过其N端CARD结构域募集Caspase 9形成凋
23、亡复合体，Caspase 9同性活化。（3）活化的Caspase 9进一步活化执行Caspase引起细胞凋亡。第三十四页，本课件共有42页4 Caspase4 Caspase非依赖型细胞凋亡非依赖型细胞凋亡u细胞剔除Caspase基因仍能凋亡，推测细胞内存在不依赖于Caspase的凋亡途径，但机制尚不清楚。u线粒体在Caspase非依赖型细胞凋亡中可能也发挥关键性作用，除Cyt C，线粒体能够向细胞质内释放多个凋亡相关因子，引发Caspase非依赖的细胞凋亡。u凋亡诱导因子（AIF）：位于线粒体外膜。凋亡时移到核中，激活某种核酸内切酶引起染色质凝集断裂。u限制性核酸内切酶G（Endo G）：位
24、于线粒体内，修复线粒体DNA。凋亡时进入核中剪切DNA产生200bp单位片段。第三十五页，本课件共有42页u凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有双重功能。在细胞正常的生理状态下，AIF作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c（Cyt-c）和NAD之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从线粒体转位到核内，引起细胞染色体的凝聚和DNA50kb的片段化。u核酸内切酶核酸内切酶G(endoG)是一种线粒体特异的核酸酶，负责线粒体DNA的修复与复制，在细胞凋亡时转位到细胞核。核
25、酸内切酶G能不依赖于将DNA切割成核小体片段。第三十六页，本课件共有42页5 5 细胞凋亡调控细胞凋亡调控凋亡相关的基因和蛋白凋亡相关的基因和蛋白Caspase抑制因子抑制因子：抑制凋亡。IAP家族（inhibitor of apoptosis,凋亡抑制子）：有BIR结构域，可直接与Caspase结合，抑制其活性。有7个成员，如：c-IAP1等。c-FLIP(FADD样Caspase抑制蛋白）、BAR、ARC（含CARD结构域的凋亡抑制子）：可与接头蛋白等相互作用阻断死亡信号传递到Caspase。病毒编码c-FLIP同源蛋白v-FLIP：结构作用类似c-FLIP。含有的DED结构域与FADD结
26、合，阻止Caspase与FADD结合。Caspase抑制因子的抑制因子：促进调亡。IAP抑制蛋白：结合IAP，释放Caspase。如线粒体释放的Smac、Omi。第三十七页，本课件共有42页细胞存活因子：包括多种有丝分裂原和生长因子细胞存活因子：包括多种有丝分裂原和生长因子他们与细胞表面的受体结合，启动胞内信号途径，抑制凋亡的发生。与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基都参于对细胞凋亡的凋控，研究较多的有NF-B、p53、ATM等：lNF-B（nuclear factor B）：）：凋亡抑制因子。多种生长因子通过磷脂酶C-PKC途径磷酸化抑制因子IB（inhibitor B)从而激活NF-B，NF-
27、B进入核中激活转录c-IAP、及c-FLIP、Bcl-xL等抑制凋亡调控蛋白。lP53：重要的肿瘤抑制基因和凋亡促进因子,基因组的守护者。辐射诱导的DNA损伤可通过ATM激活p53，阻断细胞周期，并提高Fas、Bax、Apaf-1的表达，诱导凋亡。第三十八页，本课件共有42页二、植物和酵母细胞凋亡二、植物和酵母细胞凋亡植物和酵母中没有发现编码Caspase的基因。u植物导管、通气组织分化，单性花发育，胁迫及对病原体的反应中等均有细胞凋亡现象。凋亡形态与动物细胞不同。u胁迫、低浓度双氧水、抗真菌肽等可诱导酵母细胞凋亡，凋亡形态调控蛋白与动物细胞类似。第三十九页，本课件共有42页植物细胞的程序性死
28、亡植物细胞的程序性死亡u与动物细胞PCD有许多相同的形态和生化特征 如细胞质的凝缩、细胞皱缩、核DNA断裂等。u与动物PCD之间也存在不同之处 因细胞壁的存在不会形成凋亡小体而被周围细胞吞噬,而是被液泡中的分解酶消化掉,有些植物PCD后成为植物组织的一部分如木质部导管分子等植物细胞的程序性死亡；植物细胞核DNA降解后有的研究表明电泳出现50kb的条带,有的表明与动物细胞一样出现200kbDLadder。目前在植物中也发现有类caspase存在,并确认液泡加工酶(VPEs)、metacaspases和丝氨酸内肽酶(sapases)具有caspase的作用,并证实类caspase参与植物的生长发育、抗病性及胁迫诱导的细胞程序性死亡等。第四十页，本课件共有42页植物细胞程序性死亡的形态学模式图第四十一页，本课件共有42页感感谢谢大大家家观观看看第四十二页，本课件共有42页