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1、关于细胞凋亡与衰老第一页，本课件共有33页概念：概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，也常常被称为细胞程序动结束生命的过程，也常常被称为细胞程序死亡（死亡（programmed cell deathprogrammed cell death，PCDPCD）。）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。第二页，本课件共有33页细胞凋亡的生理和病理学意义细胞凋亡的生理和病理学意义生理学意义生理学意义1.生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质形成；物变态；皮肤角质形成；2.
2、免疫细胞分化：克隆选择；免疫细胞分化：克隆选择；3.防御：清除衰老细胞、防御：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞、和被病损伤的细胞、和被病原体感染的细胞。原体感染的细胞。第三页，本课件共有33页病理学意义病理学意义1.病原体侵染；病原体侵染；诱导凋亡诱导凋亡HIV抑制凋亡抑制凋亡Poxvirus2.细胞凋亡不足细胞凋亡不足肿瘤，自身免疫疾病；肿瘤，自身免疫疾病；3.细胞凋亡过度细胞凋亡过度神经退行性疾病（神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍再生障碍性贫血、骨组织坏死。性贫血、骨组织坏死。第四页，本课件共有33页诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子物物理理性性
3、因因子子，包包括括射射线线（紫紫外外线线，射射线线等等），较较温温和和的的温温度度刺刺激激（如如热热激激，冷冷激）等激）等化化学学及及生生物物因因子子：包包括括活活性性氧氧基基团团和和分分子子，DNA DNA 和和蛋蛋白白质质合合成成的的抑抑制制剂剂，激激素素，细细胞胞生生长长因因子子，肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子（TNFTNF），抗抗Fas/Apo-1/CD95Fas/Apo-1/CD95抗体等抗体等第五页，本课件共有33页细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法 1.1.形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 2.DNA2.DNA电泳电泳ladderladde
4、r 3.3.流式细胞技术流式细胞技术 4.4.彗星电泳法（彗星电泳法（comet assaycomet assay）5.Annexin V 5.Annexin V 检测细胞膜外表面检测细胞膜外表面PS(PS(磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸)6.TUNEL 6.TUNEL测定法，即测定法，即DNADNA断裂的原位末端标记法断裂的原位末端标记法第六页，本课件共有33页区别点区别点细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死起因起因生理或病理性生理或病理性病理性变化或剧烈损伤病理性变化或剧烈损伤范围范围单个散在细胞单个散在细胞大片组织或成群细胞大片组织或成群细胞细胞膜细胞膜保持完整，一直到形成凋亡保持完整，一直到形成
5、凋亡小体小体破损破损染色质染色质凝聚在核膜下呈半月状凝聚在核膜下呈半月状呈絮状呈絮状细胞器细胞器无明显变化无明显变化肿胀、内质网崩解肿胀、内质网崩解细胞体积细胞体积固缩变小固缩变小肿胀变大肿胀变大凋亡小体凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬吞噬基因组基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成蛋白质合成有有无无调节过程调节过程受基因调控受基因调控被动进行被动进行炎症反应炎症反应无，不释放细胞内容物无，不释放细胞内容物有，释
6、放内容物。有，释放内容物。第七页，本课件共有33页常用检测细胞凋亡的染料：常用检测细胞凋亡的染料：二乙酸荧光素（二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色。），绿色荧光，活细胞染色。Hoechst33342或或33258，DAPI，吖啶橙（，吖啶橙（AO），半），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。溴化乙啶（溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（）、碘化丙啶（PI）、放线菌素）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。），不通透，正常和凋亡细胞拒染。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。第八页，本课件共有33页
7、细胞凋亡的分子调控机理细胞凋亡的分子调控机理 线线 虫虫(C.elegans)(C.elegans)凋凋 亡亡 研研 究究 发发 现现ced3,ced4ced3,ced4基基因因促促进进细细胞胞凋凋亡亡，ced9ced9基基因因阻阻止止ced3/ced4ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。的激活，抑制细胞凋亡。第九页，本课件共有33页Caspase家族与凋亡CaspaseCaspase家族家族 CaspaseCaspase活性位点是半胱氨酸活性位点是半胱氨酸(Cysteine)(Cysteine)，裂解靶，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称
8、为C Cysteine ysteine aspaspartic acic specific proteartic acic specific proteasease，即，即CaspaseCaspase.Caspase1 Caspase1即即ICE(ICE(白介素白介素-1-1b b转换酶转换酶),),是是Ced3Ced3在在哺乳动物细胞中的同源蛋白哺乳动物细胞中的同源蛋白.第十页，本课件共有33页Caspase家族与凋亡 Caspase Caspase自身以非活化的自身以非活化的ProcaspaseProcaspase存在，存在，其激活依赖于其他的其激活依赖于其他的CaspaseCaspase
9、在它的天冬氨酸位在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化点裂解活化或自身活化Caspase活化活化第十一页，本课件共有33页胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 当当细细胞胞接接受受凋凋亡亡信信号号分分子子(Fas,TNF(Fas,TNF等等)后后，凋凋亡亡细细胞胞表表面面信信号号分分子子受受体体相相互互聚聚集集并并与与细细胞胞内内的的衔衔接接蛋蛋白白(Adaptor(Adaptor protein)protein)结结合合，这这些些衔衔接接蛋蛋白白又又募募集集ProcaspasesProcaspases聚聚集集在在受受体体部部ProcaspaseProcaspase相相互
10、互活活化化并并产产生生级级联联反反应应，使使细细胞胞凋凋亡亡.下游下游CaspasesCaspases活化后，作用于底物，裂解核纤层蛋白，活化后，作用于底物，裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNaseDNase结合蛋白，使结合蛋白，使DNaseDNase释释放，降解放，降解DNADNA形成形成DNA Ladder;DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂导致膜脂PSPS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。重排，便于吞噬细
11、胞识别并吞噬。第十二页，本课件共有33页Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl-2Bcl-2是是一一种种原原癌癌基基因因，是是ced-9ced-9在在哺哺乳乳类类中中的的同同源源物物，能能抑抑制制细细胞胞凋凋亡亡；与与线线粒粒体体及及内内质质网网膜膜相相结结合合；Bcl-2Bcl-2蛋蛋白白的的羧羧基基末末端端有有一一穿穿膜膜的的结结构构域域；Bcl-2Bcl-2家家族族成成员员的的基基因因中中，常常常常含含有有三三个个保守的保守的Bcl-2Bcl-2同源区，即同源区，即BH1BH1，BH2BH2和和BH3BH3第十三页，本课件共有33页Bcl-2、线粒体与线粒体与细胞凋亡细胞凋亡 当当Cas
12、pase8Caspase8活化后，它一方面作用于活化后，它一方面作用于Procaspase3Procaspase3，另一方面使，另一方面使BidBid裂解成裂解成2 2个片个片段，其中含段，其中含BH3BH3结构域的结构域的C-C-端片段被运送到线端片段被运送到线粒体，与粒体，与Bcl-2/BaxBcl-2/Bax的的BH3BH3结构域形成复合物，结构域形成复合物，导致细胞色素导致细胞色素C C释放。释放。CytCCytC与胞质中与胞质中Ced4Ced4同源同源物物Apaf-1(Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子凋亡蛋白酶活化因子apoptosis apoptosis protease acti
13、vating factor)protease activating factor)结合并活化结合并活化Apaf-1Apaf-1，活化的，活化的Apaf-1Apaf-1再活化再活化Procaspase9Procaspase9，最后引起细胞凋亡最后引起细胞凋亡.第十四页，本课件共有33页Apaf-1l凋亡酶激活因子凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），线虫的同源物为），线虫的同源物为ced-4。l作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。lApa
14、f-1与与cytc、ATP/dATP结合后，召集结合后，召集caspase-9，形成凋亡体（，形成凋亡体（apoptosome），激活），激活caspase-3，启动，启动caspase级联反应。级联反应。第十五页，本课件共有33页Fas Fas Fas又称作又称作APO-1/CD95APO-1/CD95，属，属TNFTNF受体家族。受体家族。FasFas基基因编码产物为分子量因编码产物为分子量45KD45KD的跨膜蛋白，分布于的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的胸腺细胞，激活的T T和和B B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。脾、肺、心、脑、
15、肠、睾丸和卵巢细胞等。FasFas蛋白与蛋白与FasFas配体结合后，会激活配体结合后，会激活caspasecaspase，导致靶，导致靶细胞走向凋亡。细胞走向凋亡。第十六页，本课件共有33页p53是一种抑癌基因，其生物学功能是监是一种抑癌基因，其生物学功能是监视视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到胞增殖，直到DNA修复完成。如果修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡不能被修复，则诱导其调亡第十七页，本课件共有33页myc在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。过度表达，它
16、能促进细胞增殖、抑制分化。在在凋亡细胞中凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。促进细胞增殖，反之细胞凋亡。第十八页，本课件共有33页细胞凋亡的途径细胞凋亡的途径细胞凋亡的途径主要有两条，一条是细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的通过胞外信号激活
17、细胞内的caspase、另、另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活激活caspase。这些活化的。这些活化的caspase可将细可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。第十九页，本课件共有33页1Fas介导的细胞凋亡介导的细胞凋亡凋亡受体途径凋亡受体途径细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它）家族的跨膜蛋白，它们包括们包括Fas（Apo-1/CD95）、）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和和DR5/TRAIL-R2。其配体属于。其
18、配体属于TNF家族，家族，目前已比较清楚的是目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡介导的细胞凋亡途径。途径。第二十页，本课件共有33页2线粒体与细胞凋亡线粒体与细胞凋亡细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素素c释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素c能与能与Apaf-1、caspase-9前体、前体、ATP/dATP形成凋亡复形成凋亡复合体（合体（apoptosome），然后召集并激活），然后召集并激活caspase-3，进而引发，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。级联反应，导致细胞凋亡。第二十一页，本课件共有
19、33页细胞自噬-细胞中寿命较长蛋白的降解方式细胞中寿命较长蛋白的降解方式-由溶酶体进行降解由溶酶体进行降解-细胞中出现双层膜包被的自噬泡细胞中出现双层膜包被的自噬泡-自噬小体自噬小体-细胞可通过自噬自我销毁细胞可通过自噬自我销毁-分子机制了解较少分子机制了解较少,明确的有明确的有PI3K第二十二页，本课件共有33页细胞衰老细胞衰老(cellularaging或或cellsenescence)Hayflick界限界限(HayflickLimitation）细胞在体内条件下的衰老细胞在体内条件下的衰老衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理第二十三页，本课件共有33
20、页复制性衰老（复制性衰老（replicative senescence）l细胞的增殖次数是有限的，称细胞的增殖次数是有限的，称“Hayflick”界限。界限。如人胚成纤维细胞可培养如人胚成纤维细胞可培养60-70代。代。lDNA每复制一次端粒就缩短一段，到一定程度时，每复制一次端粒就缩短一段，到一定程度时，则激活则激活DNA损伤检验，细胞凋亡。人的成纤维细胞损伤检验，细胞凋亡。人的成纤维细胞端粒每年缩短端粒每年缩短14-18bp。l端粒酶可修复端粒，此酶仅在干细胞中表达。端粒酶可修复端粒，此酶仅在干细胞中表达。第二十四页，本课件共有33页 细胞在体内条件下的衰老细胞在体内条件下的衰老在在机机体
21、体内内，细细胞胞的的衰衰老老和和死死亡亡是是常常见见的的现现象象，甚至在个体发育的早期也会发生甚至在个体发育的早期也会发生正正常常情情况况下下终终生生保保持持分分裂裂的的细细胞胞，其其分分裂裂能能力力是是否否随随着着有有机机体体年年龄龄的的增增高高而而下下降降？它它们们 会会不不会衰老？会衰老？衰衰老老动动物物体体内内，细细胞胞分分裂裂速速度度显显著著减减慢慢，其其原因主要是原因主要是G G1 1期明显延长期明显延长 衰衰老老个个体体内内的的环环境境因因素素影影响响了了细细胞胞的的增增殖殖和和衰老衰老 骨骨髓髓干干细细胞胞移移植植实实验验说说明明随随着着年年龄龄的的增增加加，干细胞增殖速度也趋
22、缓慢干细胞增殖速度也趋缓慢第二十五页，本课件共有33页 衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化细胞核的变化细胞核的变化内内质质网网的的变变化化:衰衰老老动动物物内内质质网网成成分分弥弥散散性性地地分分散散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了线粒体的变化线粒体的变化通通常常，细细胞胞中中线线粒粒体体的的数数量量随随龄龄减减少少，而而其其体体积积则随龄增大则随龄增大 致密体的生成致密体的生成第二十六页，本课件共有33页 衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化膜系统的变化膜系统的变化 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小
23、衰衰老老细细胞胞间间间间隙隙连连接接及及膜膜内内颗颗粒粒的的分分布布也也发发生生变化变化第二十七页，本课件共有33页核核增大、染色深、核内有包含物增大、染色深、核内有包含物染色质染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜质膜粘度增加、流动性降低粘度增加、流动性降低细胞质细胞质色素积聚、空泡形成色素积聚、空泡形成线粒体线粒体数目减少、体积增大、数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失突变或丢失高尔基体高尔基体碎裂碎裂尼氏体尼氏体消失消失包含物包含物糖原减少、脂肪积聚糖原减少、脂肪积聚核膜核膜内陷内陷衰老细胞的形态变化衰老细胞的形态变化第二十八页，本课件共有33页分子水平的变化分子水平
24、的变化1.DNA：复制与转录受阻，端粒：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺缺失。失。DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。降低。2.RNA：含量减少。：含量减少。3.蛋白质：合成下降，发生修饰、交联。蛋白质：合成下降，发生修饰、交联。4.酶分子：物理与化学特征改变，酶失活。酶分子：物理与化学特征改变，酶失活。5.脂类：不饱和脂肪酸被氧化。脂类：不饱和脂肪酸被氧化。第二十九页，本课件共有33页细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理1.代谢废物积累：如：脂褐质，老年性痴呆（代谢废物积累：如：脂褐质，老年性痴呆（AD）脑）脑细胞内的细胞内的-淀粉样蛋白。
25、淀粉样蛋白。2.线粒体线粒体DNA突变：线粒体自由基浓度高，突变：线粒体自由基浓度高，mtDNA是是裸露分子，容易发生突变。裸露分子，容易发生突变。脑、心、骨骼肌的氧负荷最大，组织最易衰老。脑、心、骨骼肌的氧负荷最大，组织最易衰老。caloricrestriction能延长大鼠寿命能延长大鼠寿命50%-70%。第三十页，本课件共有33页氧化性损伤学说氧化性损伤学说:该该理理论论认认为为，代代谢谢过过程程中中产产生生的的活活性性氧氧基基团团或或分分子子（reactiveoxygenspecies，ROS）引引发发的的氧氧化化性性损损伤伤的的积积累累，最最终终导导致致衰衰老老。ROS主要有三种类型
26、：主要有三种类型：O2-，即超氧自由基；，即超氧自由基；OH-，即羟自由基；，即羟自由基；H2O2。它它们们的的高高度度活活性性引引发发脂脂类类、蛋蛋白白质质和和核核酸酸分分子子的的氧氧化化性性损损伤伤，从从而而导导致致细细胞胞结结构构的的损损伤伤乃乃至至破破坏坏。清清除除ROS，就就可可以以延延长长寿寿命。命。端粒与衰老端粒与衰老:第三十一页，本课件共有33页l自由基可引起自由基可引起DNA、蛋白质、脂类氧化、变性和交、蛋白质、脂类氧化、变性和交联，实验表明联，实验表明DNA中中OH8dG随着年龄而增加。随着年龄而增加。l正常细胞内存在清除自由基的防御系统。正常细胞内存在清除自由基的防御系统。酶系统：酶系统：SOD、CAT、GSH-PX。非酶系统：维生素非酶系统：维生素E、醌类电子受体、醌类电子受体lOrr和和Sohal（1994），将），将SOD基因导入果蝇，其寿基因导入果蝇，其寿命比野生型延长命比野生型延长1/3。第三十二页，本课件共有33页感感谢谢大大家家观观看看第三十三页，本课件共有33页