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1、DNA复制基础知识复制基础知识DNA复制基础知识复制基础知识1 引言引言-基因组复制与细胞分裂的关系基因组复制与细胞分裂的关系2 复制子复制子3 DNA复制的几种形式复制的几种形式4 DNA聚合酶聚合酶5 原核生物原核生物DNA复制的基本过程复制的基本过程6 真核生物真核生物DNA复制复制7 DNA复制的调控复制的调控8 小小 结结n n重点内容：重点内容：几个重要概念：几个重要概念：几个重要概念：几个重要概念：DNADNA的复制、复制子、复制眼、的复制、复制子、复制眼、的复制、复制子、复制眼、的复制、复制子、复制眼、复制叉、复制叉、复制叉、复制叉、DNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、
2、DNADNA的半保留复制、的半保留复制、的半保留复制、的半保留复制、DNADNA的的的的半不连续复制、半不连续复制、半不连续复制、半不连续复制、DNADNA的先导链、的先导链、的先导链、的先导链、DNADNA的后随链、冈崎的后随链、冈崎的后随链、冈崎的后随链、冈崎片段；片段；片段；片段；不同生物基因组复制子数目；不同生物基因组复制子数目；不同生物基因组复制子数目；不同生物基因组复制子数目；线性线性线性线性DNADNA复复复复制末端问题的提出及解决方案；制末端问题的提出及解决方案；制末端问题的提出及解决方案；制末端问题的提出及解决方案；-复制、滚环复制复制、滚环复制复制、滚环复制复制、滚环复制及
3、及及及D-D-环复制的机制；环复制的机制；环复制的机制；环复制的机制；大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I、IIII、III III 的性质比较，的性质比较，的性质比较，的性质比较，DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶与缺口平移法制备探与缺口平移法制备探与缺口平移法制备探与缺口平移法制备探针；针；针；针；DNADNA复制的起始、延伸及终止。复制的起始、延伸及终止。复制的起始、延伸及终止。复制的起始、延伸及终止。n n了解内容：了解内容：基因组复制与细胞分裂的关系；基因组复制与细胞分裂的关系；基因组复制与细胞分裂的关系；基因组复制与细胞分裂的关系；复制叉移
4、动方向复制叉移动方向复制叉移动方向复制叉移动方向的确定；真核生物的确定；真核生物的确定；真核生物的确定；真核生物DNADNA聚合酶的种类及各自的功能；聚合酶的种类及各自的功能；聚合酶的种类及各自的功能；聚合酶的种类及各自的功能；DNADNA复制的调控。复制的调控。复制的调控。复制的调控。DNADNA复制基础知识复制基础知识 细胞细胞在每次分裂的过程中，在每次分裂的过程中，整个基因组都必整个基因组都必须精确地复制一次须精确地复制一次。如何保证这一点？如何保证这一点？两个原则两个原则(1)DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂复制的启动决定了细胞的进一步分裂;(2)复制过程完成前，细胞是不会发生分
5、裂的。复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。DNA复制基础知识2.1 复制子的定义复制子的定义2.2 不同生物复制子的数目不同生物复制子的数目2.3 复制眼概念复制眼概念2.4 复制叉概念及其移动方向的实验确定复制叉概念及其移动方向的实验确定2.5 复制的模式复制的模式-起点、方向和速度起点、方向和速度DNA复制基础知识复制基础知识DNADNADNADNA中发生一次复制的单位称为复制子中发生一次复制的单位称为复制子中发生一次复制的单位称为复制子中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)(replicon)(replicon)(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定
6、义的，复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具在复制启动位点具在复制启动位点具在复制启动位点具起始点（起始点（起始点（起始点（origin)origin)origin)origin)，在复制终止位点，在复制终止位点，在复制终止位点，在复制终止位点具具具具终点（终点（终点（终点（terminus)terminus)terminus)terminus)。起始点仅作用于所在复制子。起始点仅作用于所在复制子。起始点仅作用于所在复制子。起始点仅作用于所在复制子。注：注：注：注：在每个细胞周期
7、中，每个复制子发生一次复在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。制，且只发生一次。制，且只发生一次。制，且只发生一次。n n质粒一般质粒一般是一个自主环状的是一个自主环状的DNADNA基因组，基因组，构成一个独立复制子；构成一个独立复制子；n n原核生物原核生物基因组中一般只含一个复制基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；个基因组复制；n n真核生物真核生物基因组含多个复制子（一般基因组含多个复制子（一般40-100kb/40-100kb/
8、个）。个）。2.2 不同生物复制子的数目不同生物复制子的数目DNA复制基础知识复制基础知识复制眼：在一个长的未复制区域内复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域已经复制的区域Replication eye复制叉复制叉:双螺旋双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。两条亲本链分开使复制能进行的部位。2.4 复制叉的概念及其移动方向的确定复制叉的概念及其移动方向的确定DNA复制基础知识复制基础知识放射性自显影法：放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比记复制的移动。如
9、果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。射自显影观察。单向复制：单向复制：在复制眼的一端，一在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标种类型的标记后紧跟着另一种标记；记；双向复制：双向复制：在复制眼的两端产生在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。物中普遍存在。2.5 2.5 复制的模式复制的模式-起点、方向和速度起点、方向和速度单起点、单方向多多起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向DNA复制基础知识复
10、制基础知识3.1 线性线性DNA双链的复制双链的复制3.2 环状环状DNA双链的复制双链的复制 DNA复制基础知识复制基础知识3.1.1 线性线性DNA复制的具体表现复制的具体表现3.1.2 线性线性DNA复制时末端问题的提出复制时末端问题的提出3.1.3 线性线性DNA复制时末端问题的解决方案复制时末端问题的解决方案DNA复制基础知识复制基础知识DNA复制基础知识 所有已知的核酸聚合酶，无论是所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从聚合聚合酶都只从5端向端向3端移动，端移动，新链的合成方新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是向与聚合酶移动方向一致，即
11、只能是5 3；而对于而对于DNA的合成必需一段的合成必需一段引物引物的存在，体内的存在，体内DNA复制时，由一段复制时，由一段RNA引物起始引物起始DNA合成，起始后它必须合成，起始后它必须切除，切除后，切除，切除后，5端如何起始呢？端如何起始呢？这就提出了这就提出了线性线性DNA末端复制末端复制的问题。的问题。复制能在新合成链的复制能在新合成链的3端结束，它如何在端结束，它如何在5端启动呢？端启动呢？DNA复制基础知识(1(1(1(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如如如
12、如噬菌噬菌噬菌噬菌体：滚环产生多聚复制子）；体：滚环产生多聚复制子）；体：滚环产生多聚复制子）；体：滚环产生多聚复制子）；(2(2(2(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种几种几种几种线性病毒核酸具有与线性病毒核酸具有与线性病毒核酸具有与线性病毒核酸具有与5555端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒楚的例子是腺病毒楚的例子是腺病毒楚的例子是
13、腺病毒 DNA)DNA)DNA)DNA)。(3(3(3(3）DNADNADNADNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没使分子没使分子没使分子没有游离末端。草履虫（有游离末端。草履虫（有游离末端。草履虫（有游离末端。草履虫（ParameciumParamecium）的线性线粒体的线性线粒体的线性线粒体的线性线粒体DNADNADNADNA的复的复的复的复制中就形成了一种交联；制中就形成了一种交联；制中就形成了一种交联；制中就形成了一种交联；(4(4(4(4）末端是可变的，而不是精确
14、确定的。末端是可变的，而不是精确确定的。末端是可变的，而不是精确确定的。末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可真核生物染色体可真核生物染色体可真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，能采用这种方式，在这种情况下，能采用这种方式，在这种情况下，能采用这种方式，在这种情况下，DNADNADNADNA末端的短重复序列的拷贝末端的短重复序列的拷贝末端的短重复序列的拷贝末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；数改变（如端粒的复制）；数改变（如端粒的复制）；数改变（如端粒的复制）；DNA复制基础知识复制基础知识The rolling circle replicates DNAPhag
15、e A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy.Adenovirus terminal protein binds to the 5 end of DNA and provides a C-OH end to prime synthesis of a new DNA strand.（2）某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制Adenovirus DNA replication is initiated separately a
16、t the two ends of the molecule and proceeds by strand displacement.（3）DNA末端形末端形成特殊结构成特殊结构A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand.The G-tail is generated by a limited degradation of the C-A-rich strand.DNA复制基础知识复制基础知识A loop fo
17、rms at the end of chromosomal DNA.The 3 single-stranded end of the telomere(TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop.Watching flashDNA复制基础知识复制基础知识3.2.1 -复制复制3.2.2 滚环复制滚环复制3.2.3 D-环复制环复制DNA复制基础知识复制基础知识3.2.2 滚环复制滚环复制replication by rolling cycles structuren nX174X174噬菌
18、体由一个单链环状噬菌体由一个单链环状DNADNA组成，这条链组成，这条链称为正（称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。双链体的复制以滚环复制方式进行。The A protein is cis-actingPhage X174The replication by rolling cycle structure3.2.3 D-环复制环复制Replication by displacement loop structureD-环复制环复制（Replication by displacement loop structure)DN
19、A复制基础知复制基础知识识4.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能聚合酶的种类及其功能4.2 真核生物真核生物DNA聚合酶的种类及其功能聚合酶的种类及其功能4.3 DNA聚合酶所具有的共同结构聚合酶所具有的共同结构4.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能聚合酶的种类及其功能SOS 修复修复性性 质质聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶II聚合酶聚合酶III35外切外切+5 3外切外切+-新生链的合成新生链的合成-+生物学活性生物学活性10.0515生物学功能生物学功能切除引物切除引物切除引物切除引物修复修复修复修复DNADNA修复修复DNA复复 制制4.1.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA
20、聚合酶聚合酶 I、II、III 的性质比较的性质比较（1）DNA聚合酶聚合酶 I 103 kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的端的2/3包括聚合酶活性位点；包括聚合酶活性位点；N端的端的1/3包含核包含核酸外切酶校正活性（一次可切除酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。个碱基）。（2）利用利用DNA聚合酶聚合酶 I 进行缺口平移法制备探针进行缺口平移法制备探针的基本原理的基本原理4.1.2 DNA聚合酶聚合酶 I 与缺口平移法制备探针与缺口平移法制备探针Nick translation replaces part of a pre-exist
21、ing strand of duplex DNA with newly synthesized material.DNase 4.2 真核生物真核生物DNA聚合酶的种类及其功能聚合酶的种类及其功能DNA复制基础知识复制基础知识三种细胞核三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能复制酶具有不同的功能:n nDNA polymerase 起始新链合成起始新链合成n nDNA polymerase 延伸先导链延伸先导链n nDNA polymerase 可能与后随链合成有可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能关，也可能具有其他功能 DNA复制基础知识复制基础知识n n许多许多DNA聚合酶有一个由三个结构
22、聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。域组成的大裂隙，类似于手形。The common organization of DNA polymerases has a palm that contains the catalytic site,fingers that position the template,a thumb that binds DNA and is important in processivity,an exonuclease domain with its own active site,and an N-terminal domain.DNA复制基础知识复制
23、基础知识5.1 DNA复制的起始复制的起始5.2 DNA合成链的延伸合成链的延伸5.3 DNA复制的终止复制的终止5.1.1 单链单链DNA的产生的产生5.1.2 3-OH引发末端的产生引发末端的产生5.1.3 复制复合体的形成复制复合体的形成DNA复制基础知识DNA复制基础知识复制基础知识解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶(helicase):(helicase):使使使使DNADNA的两条链分开，它通常利的两条链分开，它通常利的两条链分开，它通常利的两条链分开，它通常利用用用用ATPATP水解来提供必需的能量；水解来提供必需的能量；水解来提供必需的能量；水解来提供必需的能量；DNA复制基础知识复制基
24、础知识n n拓扑异构酶的种类分为拓扑异构酶的种类分为型和型和型。型。n n原核拓扑构酶原核拓扑构酶：MW=100kD，单肽链，含，单肽链，含34个个Zn。作用是暂时切断一条作用是暂时切断一条DNA链，形成酶链，形成酶-DNA共共价中间物而使超螺旋价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的松弛，然后再将切断的单链单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。连接起来。每次改变一个连环数。原核拓扑构酶原核拓扑构酶原核拓扑构酶原核拓扑构酶作用机作用机作用机作用机制：制：制：制：酶与酶与酶与酶与DNADNA结合使双链结合使双链结合使双链结合使双链解旋；解旋；解旋；解旋；使一条链切开，但酶使一条链切开，但酶
25、使一条链切开，但酶使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止与切口的两端结合阻止与切口的两端结合阻止与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；了螺旋的旋转；了螺旋的旋转；了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺酶使另一条链经过缺酶使另一条链经过缺酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连口，然后再将两断端连口，然后再将两断端连口，然后再将两断端连接起来；接起来；接起来；接起来；酶从酶从酶从酶从DNADNA上脱落，两上脱落，两上脱落，两上脱落，两条链复原，得到的条链复原，得到的条链复原，得到的条链复原，得到的DNADNA比原来少一个负超螺旋。比原来少一个负超螺旋。比原来少一个负超螺旋。比原来少一个负超螺旋。n n拓扑异
26、构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶也称旋转酶。广泛也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。次改变两个连接数。Replication machineryreplicationPositive supercoilBreak DNATopoisomerase IIpass DNA through the breaknegative supercoilDNA复制基础知识复制基础知识X174 噬菌体的噬菌体的DNA在在三种功能蛋白先后作用下三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：分开成为单链：在复制起始点，在复制起始点，
27、噬菌体噬菌体A蛋白蛋白使病毒（使病毒（+）链产生）链产生缺口。缺口。Rep蛋白蛋白提供解旋提供解旋酶活性，它使两链分离。酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的包绕单链形成稳定的单链形式。单链形式。Three proteins unwind X174 DNADNA复制基础知识复制基础知识DNA复制基础知识复制基础知识1)1)3)3)2)2)起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引发酶链结合蛋白和引发酶链结合蛋白和引发酶链结合蛋白和引发酶5.1.3 复制复合体的形成复制复合体的形成复制复合体的形成复制复合体的形成DNA复制基础知识复制基础知识5
28、.2.1 半保留复制合成两条新的半保留复制合成两条新的DNA链链5.2.2 DNA的合成是半不连续的的合成是半不连续的5.2.3 连接酶将冈崎片段连接在一起连接酶将冈崎片段连接在一起5.2.4 前导链和后随链的协调合成前导链和后随链的协调合成 5.2.5 DNA复制忠实性的控制复制忠实性的控制 DNADNA复制基础知识复制基础知识复制基础知识复制基础知识 DNA在复制时，两条链解开分在复制时，两条链解开分别作为模板，在别作为模板，在DNA聚合酶的聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以两条与模板链互补的新链，以组成新的组成新的DNA分子。这样新形分
29、子。这样新形成的两个成的两个DNA分子与亲代分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由分子的碱基顺序完全一样。由于子代于子代DNA分子中一条链来自分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制这种复制方式称为半保留复制(semiconsertive replication)。5.2.1 半保留复制合成两条新的半保留复制合成两条新的DNA链链DNA复制基础知识复制基础知识 19581958年年Meselson Meselson&stahl&stahl用同位素用同位素（1515N N）示踪标记示踪标记加密度梯度离心技加密度梯度离心技术术实验实验,该实
30、验跟该实验跟踪了生长了三代的踪了生长了三代的大肠杆菌，大肠杆菌，证明了证明了DNADNA是采取半保留是采取半保留的方式进行复制的方式进行复制。15N15N-14N14N15N-14N15N-14NDNA复制基础知识复制基础知识n nDNA DNA 复制在合成先导链（复制在合成先导链（复制在合成先导链（复制在合成先导链（leading strand)leading strand)时是时是时是时是连续的；而在合成后随链连续的；而在合成后随链连续的；而在合成后随链连续的；而在合成后随链(lagging strand)(lagging strand)时是先时是先时是先时是先形成小片段（形成小片段（形成
31、小片段（形成小片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment ），随后再将，随后再将，随后再将，随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuous replication)semidiscontinuous replica
32、tion)。DNA复制基础知识复制基础知识The two new DNA strands have different featuresOkazaki fragmentDNADNA复制基础知识复制基础知识复制基础知识复制基础知识DNA复制基础知识复制基础知识DNA复制基础知识复制基础知识n nDNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（移码（frameshift):指一个核苷酸的插入或缺失。指一个核苷酸的插入或缺失。替换（替换（substitution):指掺入错误核苷酸（不正确配对）指掺入错误核苷酸（不正确配对）n nNote:DNA聚合酶通常具有聚合酶通常具
33、有3-5核酸外切酶活性，可核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可提高提高100倍。倍。(10-310-8-10-10)细菌的细菌的DNA聚聚合酶仔细检查合酶仔细检查延长链末端的延长链末端的碱基对，如果碱基对，如果是错误的会予是错误的会予以切除。以切除。DNA polymerases have exonuclease activity 修复会把含损伤碱基的一小段修复会把含损伤碱基的一小段DNA替换掉替换掉DNA复制基础知识复制基础知识 一般说来，链的终止不需要特定一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质来的信号，
34、也不需要特殊的蛋白质来参与，到达终止位点后，参与，到达终止位点后，DNADNA聚合聚合酶离开酶离开DNADNA双链，终止发生。双链，终止发生。6 6 真核生物真核生物DNADNA复制复制 P47-48P47-487 DNA7 DNA复制的调控复制的调控 P48-50P48-50DNA复制基础知识复制基础知识复制子、复制眼、复制叉的概念复制子、复制眼、复制叉的概念线状线状DNA分子复制时末端问题的解决分子复制时末端问题的解决DNA通过半保留半不连续方式合成通过半保留半不连续方式合成细菌和真核生物都有一种以上的细菌和真核生物都有一种以上的DNA聚合酶。聚合酶。DNA复制基础知识复制基础知识起始起始
35、(initiation)(initiation)：涉及一种蛋白质复合物，它识别复：涉及一种蛋白质复合物，它识别复制起始点制起始点(origin)(origin)。在。在DNADNA合成之前，母链必须分开，合成之前，母链必须分开，并（短暂地）保持单链状态，然后在复制叉处起始子链并（短暂地）保持单链状态，然后在复制叉处起始子链的合成；的合成；延伸延伸(elongation)(elongation)：由另一个蛋白质复合体完成。只有：由另一个蛋白质复合体完成。只有当蛋白质复合体和当蛋白质复合体和DNADNA在复制处的特殊结构结合时，复在复制处的特殊结构结合时，复制体制体(replisome)(replisome)才存在，在复制体延才存在，在复制体延DNADNA移动时，母链移动时，母链分开而子链合成；分开而子链合成；终止（终止（termination)termination)：在复制子末端，终止反应是必需在复制子末端，终止反应是必需的。终止后，加倍的染色体必须分开。的。终止后，加倍的染色体必须分开。