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1、食品中各类微生物检验课件l第一节第一节食品中菌落总数的测定食品中菌落总数的测定l第二节第二节食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定l第三节第三节食品中金黄色葡萄球菌的检验食品中金黄色葡萄球菌的检验l第四节第四节食品中沙门氏菌的检验食品中沙门氏菌的检验l第五节第五节食品中志贺氏菌的检验食品中志贺氏菌的检验l第六节第六节食品中溶血性链球菌的检验食品中溶血性链球菌的检验l第七节第七节食品中病原性大肠艾希氏菌的检食品中病原性大肠艾希氏菌的检验验l第八节第八节食品中变形杆菌的检验食品中变形杆菌的检验l第九节第九节食品中空肠弯曲菌的检验食品中空肠弯曲菌的检验l第十节第十节食品中致病性弧菌检验食品中致病性
2、弧菌检验l第十一节第十一节食品中耶尔森氏菌的检验食品中耶尔森氏菌的检验l第十三节第十三节食品中肉毒梭菌的检验食品中肉毒梭菌的检验l第十四节第十四节食品中蜡样芽胞杆菌的检验食品中蜡样芽胞杆菌的检验l第十五节第十五节食品中产气荚膜梭菌的检验食品中产气荚膜梭菌的检验l第十六节第十六节食品中霉菌和酵母菌的检验食品中霉菌和酵母菌的检验第一节 食品中菌落总数的测定l食品中细菌数量越多，则食品腐败变质食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。如有人认为细菌数量达到良反应。如有人认为细菌数量达到1001000万个万个g时，食品就可能引起食时，
3、食品就可能引起食用者的食物中毒。用者的食物中毒。l食品中细菌数量越少，食品存放的时间食品中细菌数量越少，食品存放的时间越长。如：越长。如：l0时菌落数为105cfu/cm2的牛肉，可存放7d；菌落数为102cfu/cm2时，可存放18d。l0时菌落数为105cfu/cm2的鱼可存放6d，菌落数为103cfu/cm2时，可存放12d。菌落菌落(colony)：生长在固体：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。肉眼可见的细胞群体。菌落总数菌落总数(total colony number)：通过平板菌：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积
4、落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数。是活的细胞总数。落总数。是活的细胞总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况按国家标准方法规定，即在需氧情况下，下，3737培养培养48h48h，能在普通营养琼脂平板，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数上生长的细菌菌落总数.所以厌氧或微需氧所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，菌
5、，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此故难以繁殖生长。因此,菌落总数并不表示菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌数，需氧菌数等。检验方法 基本操作一般包括基本操作一般包括 :样品的稀释倾注样品的稀释倾注平皿培养平皿培养4848小时计数报告。小时计数报告。以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（或（或25mL)，放于，放于225mL灭菌生理盐水玻璃瓶内（瓶内预置灭菌生理盐水玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠适当数量的玻璃珠)制成制成1 1：
6、1010的均匀稀的均匀稀释液。释液。用用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀释液稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成制成1：100的稀释液的稀释液l另取另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支支1mL灭菌吸管。灭菌吸管。倾注培养倾注培养l根据标准要求或对污染情况的估计，选择根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个个适宜稀释度，分别在制适宜稀释度，分别在制
7、10倍递增稀释的同时，以倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。中，每个稀释度做两个平皿。l将凉至将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。作空白对照。l待琼脂凝固后，翻转平板，置待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍，取出计算平板内菌落数目，乘以稀
8、释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。u计数和报告计数和报告 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。u我国饮用水卫生标准：我国饮用水卫生标准：100个细菌总数个细菌总数/1mL饮水饮水第二节 食品中大肠菌群的测定l一、大肠菌群与食品卫生质量一、大肠菌群与食品卫生质量l大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在37能发酵乳糖、产酸、能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞的无芽胞杆菌。杆菌。l从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌
9、，其中有埃希氏菌属，特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等。枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等。以埃希氏菌属为主。以埃希氏菌属为主。l大肠菌群大肠菌群MPN是指在是指在100mL(或或100g)食品检样食品检样中所含的大肠菌群的最近似或最可能数。中所含的大肠菌群的最近似或最可能数。大肠杆菌大肠杆菌(埃希氏菌属埃希氏菌属 Escherichine)是人类和动物肠道中的正常菌群出生后数小时就进入肠道，并终生伴随以大肠埃希氏菌（E.coli）最为重要在环境和食品卫生学上，在环境和食品卫生学上，常被用作常被用作粪便污染的检测指标粪便污染的检测指标；作为作为肠
10、道病原菌污染食品的指示菌肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检验出大肠菌群，只能说明有当然食品中检验出大肠菌群，只能说明有肠道病原菌存在的可能，两者并非一定平行肠道病原菌存在的可能，两者并非一定平行存在。但只要食品中检出大肠菌群，则说明存在。但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染。该食品仍可被认为是不卫生的。有粪便污染。该食品仍可被认为是不卫生的。卫生学指标卫生学指标在分子生物学和基因工程实验中在分子生物学和基因工程实验中重要的实验材料和研究对象重要的实验材料和研究对象大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象正常菌群，一般不致病正常菌群，一般不致病1、条件
11、致病某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染两大原因可以致病两大原因可以致病细菌居住部位改变引起的肠外感染；尿路感染最常见2、致病菌株日本再度发生O157病菌感染事件-新华网东京月日专电日本最近再度发生病原性大肠杆菌集体感染事件，到日为止，东京、千叶、埼玉、神奈川、茨木、群马等地已有人受到感染。这次集体感染于月日首先在千叶县柏市被发现。诊断和调查结果表明，患者是由于食用了一些工厂生产的不洁净的食品而被感染的。日本曾于、年前首次发生病原性大肠杆菌集体感染事件。患者有发烧、恶心、呕吐等症状。2001年年4月月9日日17:29新华网报道新华网报道l2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大年，江苏、安徽等
12、地，肠出血性大肠杆菌肠杆菌O157:H7，造成，造成177人死亡，中毒人死亡，中毒人数超过人数超过2万人。万人。u大肠菌群大肠菌群MPN的常规检验方法是将不同的常规检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵乳糖胆盐发酵管内管内，经一定的温度、时间发酵，若均，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性；如有产气者，不产气者则可报告为阴性；如有产气者，则需进行分离培养，证实试验，然后查则需进行分离培养，证实试验，然后查取取MPN检索表，报告出每检索表，报告出每100mL(g)大肠大肠菌群的最近似数。大肠菌群菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验的检验程序如下：程
13、序如下：检样稀释：检样稀释：(1)以无菌操作将检样以无菌操作将检样25mL(或或25g)放于含放于含有有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃瓶内预置适当数量的玻璃珠珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以匀质器。以8000-10000转分钟的速度处转分钟的速度处理理1分钟，做成分钟，做成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。(2)用用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀轻液稀轻液1mL注入含有注入含有9mL灭菌生理
14、盐水或其它稀释灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀作液的试管内，振摇试管混匀作1：10的的稀释液。稀释液。操作步骤操作步骤(3)另取另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用用1支支1mL灭菌吸管：灭菌吸管：(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，况的估计，选择三个稀释度，每个稀释选择三个稀释度，每个稀释度接度接种种3管。管。操作步骤操作步骤检验方法检验方法(一一)乳糖发酵试验乳糖发酵试验在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在乳糖发酵试验工作中，经常可以
15、看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一浮，即应考虑可能有
16、气体产生，而应作进一步试验。步试验。操作步骤操作步骤将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；发酵管；1mL及及1mL以下者，用单料乳以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置管，置36+1温箱内，培养温箱内，培养24+2小时，如所有小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。序进行。操作步骤操作步骤(二二)分离培养分离培养将产气的发酵管分别转种到
17、伊红美将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置361温箱内培养温箱内培养1824小小时，然后取时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。证实试验。操作步骤操作步骤证实试验证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落菌落12个进行革兰氏染色。同时接种个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵乳糖发酵管，置管，置361温箱内培养温箱内培养24+2小时，观察产气情况，小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，
18、即可报告为大肠菌群阳性即可报告为大肠菌群阳性。操作步骤操作步骤报告报告 根据证实为大肠群阳性的管数，查根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表的检索表(见附录一见附录一)，报告每，报告每100mL(g)大肠菌群的最近似数大肠菌群的最近似数(MPN)。u大肠菌群检验中常用的抑菌剂有大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐胆盐、十二烷十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革革兰氏阳性菌兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，
19、行业标准中管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。u抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。的某些菌株有时也产生一些抑制作用。大肠菌群大肠菌群MPN的其它检验方法的其它检验方法l大肠菌群大肠菌群MPN的其他测定方法有琉水网的其他测定方法有琉水网膜法、膜法、TTC（2、3、5、氯化三苯四氮氯化三苯四氮唑）显色法，
20、唑）显色法，DC(去氧胆酸钠去氧胆酸钠)半固体法、半固体法、纸片法等。纸片法等。l我国饮用水卫生标准：我国饮用水卫生标准：l3个大肠菌群个大肠菌群/1L饮水饮水北美国家一般使用北美国家一般使用“粪大肠菌群粪大肠菌群”概念，如概念，如AOAC、FDA。SN中的中的“粪大肠菌群粪大肠菌群”概念为等同采用概念为等同采用AOAC方法，故而使方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群耐热大肠菌群”概念，较概念，较少使用少使用“粪大肠菌群粪大肠菌群”。项目项目依据依据耐热大肠菌群耐热大肠菌群NMKL、ISO粪大肠菌群粪大肠菌群NMKLAOAC 定义定义在在44.5培
21、养，培养，24h内能产酸产内能产酸产气的细菌气的细菌在胰蛋白胨肉汤中于在胰蛋白胨肉汤中于44.5，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群内产生吲哚的耐热大肠菌群于于LST中中36培养培养48h内产气，内产气，并于并于EC内培养内培养4424h产气的产气的一群细菌一群细菌 第三节 食品中金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌急性化脓性感染急性化脓性感染食物中毒食物中毒正常人带菌，正常人带菌，30-80%通过工人手和呼吸道污染食品通过工人手和呼吸道污染食品 金黄色葡萄球菌在生金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激牛奶、熟肉制品及冰激凌凌等等3类食品中的检出率为类食品中的检出率为19.67%；前两
22、种食品；前两种食品的污染率分别为的污染率分别为25.13%和和20.33%。浙江浙江CDC2000-2004年监控结果年监控结果金葡感染染色观察在BP平板上的典型菌落大阪市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业大阪市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有人被送往医院，目前还有人在医院接受治疗。人被送往医院，目前还有人在
23、医院接受治疗。据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制品染菌是品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。生产设备没有按规定定期清洗而造成的。媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人(2000年年7月月6日日12:39)检验方法检验方法 l样品处理样品处理：无菌取：无菌取25g或或25mL食品样品，食品
24、样品，放入放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成灭菌生理盐水中均质，制成1：10稀释液。稀释液。l增菌培养增菌培养：将：将1：10稀释液接入稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37C培养培养24小时。小时。l分离培养分离培养：将上述稀释液或培养液分别划：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和线血平板和Baird-Parker平板，置平板，置37C培培养养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌平
25、板上菌落为圆形，直径落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。周围有一浑浊带。l染色观察染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径荚膜，直径0.5-1m。l血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验：吸取：吸取0.5mL兔血浆与兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时小时培养物充分混匀，置培养物充分混匀，置361C培养，培养，每隔每隔半小时观察一次，连续观察半小时观察一次，连续观察
26、6小时，小时，出现出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。照。l耐热核酸酶试验：耐热核酸酶试验：将将24小时肉汤培养物小时肉汤培养物沸水浴处理沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于，用接种环划线刺种于甲苯胺兰甲苯胺兰-DNA平板，平板，361C培养培养24小时，小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。第四节 食品中沙门氏菌的检验其中许多为人畜共患病一大群人与动物肠道中的寄生菌菌群菌型甚多，仅少数对人致病沙门氏菌沙门氏菌广泛存在于动物广泛存在于动物肠道、内脏中。
27、肠道、内脏中。引起中毒的主要是引起中毒的主要是动物源性食品。动物源性食品。本菌对热、消毒药及本菌对热、消毒药及外界环境的的抵抗力外界环境的的抵抗力不强。不强。60，20-30min即被杀死。即被杀死。1、致病物质：致病性与免疫性致病性与免疫性侵袭力：O抗原、VI抗原毒 素：内毒素2、所致疾病：伤寒副伤寒食物中毒（急性胃肠炎，表现为头痛、恶心、面色苍白、出冷汗、随之出现呕吐腹泻、体温升高，并伴有水样便，有时带脓血粘液，重者出现寒战、抽搐和昏迷等病程37d，死亡率0.5%。）败血症外毒素-肠毒素l伤寒未接受过治疗的病人致死率可超过伤寒未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当治疗的病人其致
28、死，而对经过适当治疗的病人其致死率低于率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。门氏菌携带者。这些无症状携带者不显这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒传统的例子就是玛丽伤寒)。l非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。沙门氏菌携带者。胆囊-肠道-粪排菌皮肤-血拴出血-玫瑰疹肾-尿肝脾-肿大骨髓-受抑制伤寒和副
29、伤寒的致病过程伤寒和副伤寒的致病过程伤寒和副伤寒杆菌小肠上部粘膜肠系膜淋巴结 固有层淋巴结进入血液再次进入血液第一次菌血症第二次菌血症病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫3、免疫性沙门氏菌的预防措施：沙门氏菌的预防措施：SSOP、GMP控制个人卫生习惯，严格控制个人卫生习惯，严格洗手、消毒以及防止粪便污染水源，洗手、消毒以及防止粪便污染水源，加强加工用水的消毒。加强加工用水的消毒。食用前充分加热以及防止交叉污染食用前充分加热以及防止交叉污染沙门氏菌在沙门氏菌在SS平板上平板上检验步骤检验步骤 1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒、前增菌：用无选择性的培养基使处
30、于濒死状态的沙门氏菌恢复活力。沙门氏菌死状态的沙门氏菌恢复活力。沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此，对经过加工的食品于濒死状态，因此，对经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基加任何抑菌剂的培养基BP进行增菌。进行增菌。l一般前增菌时间为一般前增菌时间为4h，不宜过长。（为，不宜过长。（为什么？）什么？）2、选择性增菌、选择性增菌l前增菌后或未加工的食品进行选择性增菌，使前增菌后或未加工的食品进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而大多数其他细菌受到抑沙门氏菌得以增殖，而大多数
31、其他细菌受到抑制。制。l直接增菌的食品应制成直接增菌的食品应制成1：1稀释液，而不能做稀释液，而不能做成成1：10稀释液，因为食品中沙门氏菌数量较稀释液，因为食品中沙门氏菌数量较少，少，1：10降低检出率，而降低检出率，而1：1稀释液可提高稀释液可提高检出率。检出率。l增菌液有：增菌液有：SC、TTB、MM。增菌时必须用一。增菌时必须用一个个SC和一个和一个TTB或或MM。（为什么？）。（为什么？）3、平板分离、平板分离l分离沙门氏菌的培养基为选择性鉴别培养基。分离沙门氏菌的培养基为选择性鉴别培养基。l沙门氏菌主要来源于粪便，而粪便中埃希氏菌沙门氏菌主要来源于粪便，而粪便中埃希氏菌属占绝对优势
32、，所以选择性增菌后，与沙门氏属占绝对优势，所以选择性增菌后，与沙门氏菌相伴随的主要是埃希氏菌属。因此，培养基菌相伴随的主要是埃希氏菌属。因此，培养基中加入的指示系统主要是事沙门氏菌和埃希氏中加入的指示系统主要是事沙门氏菌和埃希氏菌属的菌落特征最大限度的分开。菌属的菌落特征最大限度的分开。l常用的分离沙门氏菌的选择性培养基有：常用的分离沙门氏菌的选择性培养基有：BS、DHL、HE、WS、SS。4、生化试验鉴定到属、生化试验鉴定到属l初步生化试验：三糖铁试验。测定细菌初步生化试验：三糖铁试验。测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、产气好对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、产气好产硫化氢情况。产硫化氢情况。l
33、其他生化试验：靛基质、尿素、氰化钾、其他生化试验：靛基质、尿素、氰化钾、赖氨酸，赖氨酸，4项。项。l若硫化氢若硫化氢+、靛基质、靛基质-、尿素、尿素-、氰化钾、氰化钾-、赖氨酸赖氨酸+，这是典型沙门氏菌的反应。，这是典型沙门氏菌的反应。5、血清学分型试验、血清学分型试验沙门氏菌快速检验的新方法l免疫荧光抗体法l酶联免疫吸附测定法（ELISA）lPCR技术第五节 食品中志贺氏菌的检验多数不分解乳糖志贺氏菌志贺氏菌shigella是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称通称痢疾杆菌痢疾杆菌dyseaterybacteria革兰氏阴性菌、无荚膜、无鞭毛，有菌毛生化反应
34、低于其他肠道杆菌，对酸敏感形态对理化因素的低抗力抗原与分类抗原与分类根据O抗原分类亚型111516，X，Y变种110型DCBA群宋内氏志贺菌宋内氏志贺菌鲍氏志贺菌鲍氏志贺菌福氏志贺菌福氏志贺菌痢疾志贺菌痢疾志贺菌 菌种菌种分为4群39个血清型（包括亚型）致病性致病性人类是唯一的患者和带菌者粪口传播感染灶局限于结肠粘膜层，一般不入血病后免疫期短，也不巩固致病性较强，感染10-200个即可发病。致病物质致病物质1、侵袭力：、侵袭力：菌毛有利于菌粘附至肠粘膜2、毒、毒素素：加重局部和全身症状内毒素作用于肠壁通透性增加粘膜炎症、溃疡局部全身内毒素血症外毒素（A群1型）与内毒素协同作用 临床表现临床表现
35、急性细菌性痢疾急性细菌性痢疾急性典型：发热、腹痛、脓血粘液便非急性典型：小儿中毒型 成人易误漏诊慢性细菌性痢疾：病程迁移二月以上 中毒性痢疾病人检验方法1、增菌培养、增菌培养：GN增菌液，增菌液，68h。2、选择性鉴别培养基分离志贺氏菌、选择性鉴别培养基分离志贺氏菌选择性琼脂平板有选择性琼脂平板有HE、SS、EMB、麦康、麦康凯。这些培养基中都含有乳糖。在这些凯。这些培养基中都含有乳糖。在这些平板上志贺氏菌的菌落为无色半透明不平板上志贺氏菌的菌落为无色半透明不发酵乳糖。发酵乳糖。3、初步生化试验、血清学分型和进一、初步生化试验、血清学分型和进一步生化试验步生化试验首先是三糖铁：斜面产碱（红色）
36、、底层首先是三糖铁：斜面产碱（红色）、底层产酸（黄色）、不产气产酸（黄色）、不产气硫化氢硫化氢-、无动力。如出现这样的结果，可、无动力。如出现这样的结果，可疑为志贺氏菌，接着做血清学试验。疑为志贺氏菌，接着做血清学试验。注意l志贺氏菌在常温存活期较短，因此，当样品采集后，应尽快进行检验。l如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内l如果要较长时间保存，必须放在低温冰箱内。第六节 食品中溶血性链球菌的检验l溶血性链球菌在自然界分布较广，可存在于水、溶血性链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、牛奶、粪便等中。按其在血平板上溶血空气、牛奶、粪便等中。按其在血平板上溶血能力分类，可分为能力分类，可分为
37、甲型甲型溶血性链球菌、溶血性链球菌、乙型乙型溶溶血性链球菌、血性链球菌、丙型丙型溶血性链球菌、溶血性链球菌、亚甲型亚甲型溶血溶血性链球菌。性链球菌。l与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，常可引起常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症皮肤和皮下组织的化脓性炎症及及呼吸呼吸道感染道感染。还可以通过食品引起。还可以通过食品引起猩红热、流行性猩红热、流行性咽炎咽炎的爆发性流行。的爆发性流行。培养特性l需氧或兼性厌氧。营养要求较高，普通需氧或兼性厌氧。营养要求较高，普通培养基上生长不良，在加有血液、血清、培养基上生长不良，在加有血液、血清、腹水等的培养基中生长
38、良好，大多数菌腹水等的培养基中生长良好，大多数菌株需苏氨酸、核黄素、维生素株需苏氨酸、核黄素、维生素B6、烟酸、烟酸等生长因子。等生长因子。l最适生长温度最适生长温度37，最适，最适pH7.47.6。毒素和酶l致病性链球菌可产生多种毒素和酶。致病性链球菌可产生多种毒素和酶。l溶血素、红疹毒素、透明质酸酶、链激溶血素、红疹毒素、透明质酸酶、链激酶、杀白细胞素等。酶、杀白细胞素等。抵抗力l不强。不强。60，30min即被杀死。即被杀死。l乙型溶血性链球菌对青霉素、红霉素、乙型溶血性链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺都很敏感。氯霉素、四环素、磺胺都很敏感。l青霉素是溶血性链球菌感染的首选药
39、物。青霉素是溶血性链球菌感染的首选药物。检验步骤l样品处理l一般培养l分纯培养l链激酶试验l杆菌肽敏感试验第七节 食品中病原性大肠埃希氏菌的检验l大肠埃希氏菌，大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌俗称大肠杆菌，肠杆菌，肠杆菌科、埃希氏属，是指那些能引起人、动科、埃希氏属，是指那些能引起人、动物感染及人的食物中毒的一群大肠杆菌。物感染及人的食物中毒的一群大肠杆菌。l大肠埃希氏菌随粪便排除后，广泛分布大肠埃希氏菌随粪便排除后，广泛分布于自然界，是一种条件致病菌。正常条于自然界，是一种条件致病菌。正常条件下不致病，而且还能合成维生素件下不致病，而且还能合成维生素B和和K，生产大肠菌素，对机体有利。，生产大肠菌
40、素，对机体有利。培养特性l需氧或兼性厌氧。最适生长温度需氧或兼性厌氧。最适生长温度37，普通培养基上生长良好。普通培养基上生长良好。l在麦康凯培养基上因发酵乳糖而产生有在麦康凯培养基上因发酵乳糖而产生有色菌落。色菌落。l在在EMB上生长成紫黑色有金属光泽的菌上生长成紫黑色有金属光泽的菌落。落。抵抗力l比其他肠道致病菌强。除少数外，都可比其他肠道致病菌强。除少数外，都可被巴氏消毒法所杀灭。被巴氏消毒法所杀灭。l在水中可存活数周至数月，在冷藏条件在水中可存活数周至数月，在冷藏条件下存活更久。下存活更久。l对磺胺、链霉素、土霉素、金霉素、氯对磺胺、链霉素、土霉素、金霉素、氯霉素等敏感。而青霉素对它的
41、作用弱，霉素等敏感。而青霉素对它的作用弱，易产生耐药菌株。易产生耐药菌株。致病性l1、致病因素：侵袭力、内毒素、肠毒素。、致病因素：侵袭力、内毒素、肠毒素。l2、所致疾病：肠外感染、腹泻、所致疾病：肠外感染、腹泻l4种大肠杆菌可引起腹泻种大肠杆菌可引起腹泻大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌O157O157侵袭性大肠杆菌（侵袭性大肠杆菌（EIEC）致泻性大肠埃希氏菌致泻性大肠埃希氏菌肠毒素性大肠杆菌（肠毒素性大肠杆菌（ETEC）致病性大肠杆菌（致病性大肠杆菌（EPEC）出血性大肠杆菌（出血性大肠杆菌（EHEC）致病性大肠杆菌引起的腹泻致病性大肠杆菌引起的腹泻检验程序l增菌l分离l生化试验l血清学试
42、验l肠毒素试验第八节 食品中变形杆菌的检验l变形杆菌属于肠杆菌科，包括变形杆菌属于肠杆菌科，包括普通普通变形变形杆菌、杆菌、奇异奇异变形杆菌、变形杆菌、产粘产粘变形杆菌三变形杆菌三种。种。l变形杆菌为腐败菌，广泛分布在自然界变形杆菌为腐败菌，广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内。人或动物的肠道内。l变形杆菌一般不致病，为条件变形杆菌一般不致病，为条件致病菌。致病菌。l可引起多种感染。常见感染有可引起多种感染。常见感染有呼吸道感染呼吸道感染、腹泻腹泻、尿路感染尿路感染、腹膜炎腹膜炎、中耳炎中耳炎、乳突炎乳突炎、心心内膜炎内膜炎、脑膜
43、炎入败血症，还、脑膜炎入败血症，还可引起可引起食物中毒食物中毒。l中毒食品主要中毒食品主要以动物性食品为主以动物性食品为主，其次为豆制，其次为豆制品和凉拌菜，品和凉拌菜，发病季节多在夏、秋发病季节多在夏、秋，中毒原因，中毒原因为被污染食品在食用前未彻底加热，其产生的为被污染食品在食用前未彻底加热，其产生的毒素可引起中毒。毒素可引起中毒。变形杆菌食物中毒是我国常见的食物中毒之一。变形杆菌食物中毒是我国常见的食物中毒之一。l抵抗力：不耐热，于抵抗力：不耐热，于60，530min皆可杀死。皆可杀死。变形杆菌属自然耐药菌株多，治疗时应做药物变形杆菌属自然耐药菌株多，治疗时应做药物敏感试验，一般认为敏感
44、试验，一般认为卡那霉素卡那霉素为首选药物，有为首选药物，有一定的疗效。一定的疗效。检验程序u增菌培养增菌培养u分离培养分离培养u初步鉴定初步鉴定u最后鉴定最后鉴定u食物中毒检验食物中毒检验食物中毒检验发生食物中毒案件时，除自粪便、呕吐发生食物中毒案件时，除自粪便、呕吐物、及可疑食物分离细菌外，还需做以物、及可疑食物分离细菌外，还需做以下试验：下试验：测定食物中变形杆菌总数；测定食物中变形杆菌总数；菌株的同一性试验；菌株的同一性试验；动物试验；动物试验；特异抗体测定。特异抗体测定。第九节 食品中空肠弯曲菌的检验l空肠弯曲菌（空肠弯曲菌（c.jejuni）菌体轻度弯曲似）菌体轻度弯曲似逗点状，菌体
45、一端或两端有鞭毛，运动逗点状，菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。膜，不形成芽胞。l微需氧菌，最适温度为微需氧菌，最适温度为3742。在正。在正常大气或无氧环境中均不能生长。常大气或无氧环境中均不能生长。l已被认为是引起急性腹泻的重要原因菌。已被认为是引起急性腹泻的重要原因菌。目前已证明为人畜共患病。目前已证明为人畜共患病。抵抗力 空肠弯曲菌抵抗力不强，易被干燥、直射空肠弯曲菌抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，日光及弱消毒剂所杀灭，56，5分钟可分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、被杀死。对红霉素、新
46、霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。近年发现了不少耐药菌株。感。近年发现了不少耐药菌株。致病性l在胆管中生长，小肠上端微需氧环境中在胆管中生长，小肠上端微需氧环境中适合本菌生长繁殖，造成适合本菌生长繁殖，造成空肠、回肠和空肠、回肠和大肠组织损伤大肠组织损伤，通过肠粘膜侵入血液。，通过肠粘膜侵入血液。检验程序l微需氧环境的制备：氧气5%、氮气85%、二氧化碳10%。（化学法、生物法、气袋法、仪器法等）l分离培养l初步鉴定l确定试验第十节 食品中致病性弧菌检验l弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌。革兰阴
47、性菌。主要包括主要包括霍乱弧菌、副溶性弧菌和创伤弧菌。霍乱弧菌、副溶性弧菌和创伤弧菌。大多数弧菌源于大多数弧菌源于海洋海洋，是嗜盐菌，嗜温性。，是嗜盐菌，嗜温性。预防措施：预防措施：l彻底烹调或预煮，并防止交叉污染彻底烹调或预煮，并防止交叉污染;l控制原料收购控制原料收购;l产品的适宜冷藏产品的适宜冷藏.形态与染色形态与染色涂片中呈穿梭样运动非常活泼液体中排列整齐呈鱼群状革兰染色阴性 弧型或逗点状，单鞭毛霍乱弧菌（霍乱弧菌（V.cholerae）培养特性培养特性耐碱不耐酸碱性琼脂平板上生长良好在pH8.89.0的碱性蛋白胨水根据O抗原不同抗原构造与分型抗原构造与分型现已有155个血清群其中O1
48、群、O139群引起霍乱 根据表型差异O1群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2 生物型古典生物型El Tor生物型霍乱弧菌考核问题霍乱弧菌考核问题抵抗力抵抗力不耐酸不耐酸，在正常胃酸中仅能存活4分钟水中存活长水中存活长，河水、井水、海水中1-3周怕热怕热，100,1-2min死亡霍乱肠毒素霍乱肠毒素:致病物质致病物质激活GS，使细胞内cAMP水平升高，主动分泌Na+、K+、HCO3和水，导致重的腹泻与呕吐B亚单位A亚单位与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞（结合亚单位）（毒性亚单位）霍乱肠毒素的作用机理1234霍乱肠毒素的作用机理 剧烈腹泻和呕吐（米泔水样腹泻物），大量
49、水分和电解质丧失，低容量性休 克及心力不齐和肾衰竭（死亡率高达60%）烈性肠道传染病，为我国的甲类法定传染病传播途径传播途径主要是通过污染的水源或食物经口摄入所致疾病所致疾病传染源传染源临床表现临床表现霍霍乱乱病人、无症状感染者上吐下泻霍乱病人免疫性免疫性感染霍乱弧菌后，机体可获得牢固免疫力副溶血弧菌副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）l分布极广的海洋细菌，为引起食物中毒分布极广的海洋细菌，为引起食物中毒重要的病原细菌之一，尤其是夏秋季节重要的病原细菌之一，尤其是夏秋季节的沿海地区，经常发生由于食用带有大的沿海地区，经常发生由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产品，引起暴发性量副溶血
50、性弧菌的海产品，引起暴发性食物中毒。食物中毒。l嗜盐性，在嗜盐性，在3037最适温度最适温度时增长较快，一般冬季不易检出。时增长较快，一般冬季不易检出。培养特性l需氧或兼性厌氧，对营养要求不高。需氧或兼性厌氧，对营养要求不高。l最适最适NaCl浓度为浓度为35g/L，110g/L以上不生以上不生长，在无盐培养基中不生长。长，在无盐培养基中不生长。l最适最适pH为为7.78.0。l本菌的一个显著特征是：从患者分离的本菌的一个显著特征是：从患者分离的菌株在含有食盐的血琼脂培养基上出现菌株在含有食盐的血琼脂培养基上出现-溶血溶血带带。这这种能引起种能引起红细红细胞溶解的胞溶解的现现象称象称为为“神奈