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1、会计学1生化校准方法生化校准方法(fngf)分析分析第一页，共17页。K因子因子(ynz)法法n n理论k值：根据摩尔系数（）来计算。通常试剂生产降价(jin ji)给出的k值都属于此。n n实测k值：是根据仪器当前的实际状态，试剂的稳定性等因子数测得的值。n n校准k值：通过高质量校准直接校准得到的k值n nK因数法适用的分析方法有一点终点法，两点终点法，两点速率法，多点速率法。第1页/共17页第二页，共17页。n nK=SV/TV&.1*106第2页/共17页第三页，共17页。n n线性两点法线性两点法n n非线性法：又称非直线性校准法非线性法：又称非直线性校准法 非线性法包括非线性法包括
2、logit-loglogit-log法、指数函数法、指数函数(hnsh)(hnsh)法、样条函数法、样条函数(hnsh)(hnsh)法等方法法等方法n nLogit-log3pLogit-log3p对数函数对数函数(hnsh)(hnsh)法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。n nP P表示参数之意，由表示参数之意，由3 3个参数（个参数（S1AbsS1Abs、k k、a a）参与计算。）参与计算。S1AbsS1Abs表示试剂空白，表示试剂空白，K K表示校准所得斜率，表示校准所得斜率，a a表示近似常数。表示近似常数。
3、n n、logit-log4plogit-log4p对数函数对数函数(hnsh)(hnsh)法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。n nP P表示参数之意，由表示参数之意，由4 4个参数（个参数（S1AbsS1Abs、k k、a a、b b）参与计算。）参与计算。S1AbsS1Abs表示试剂空白，表示试剂空白，K K表示校准所得斜率，表示校准所得斜率，a a表示近似常数。表示近似常数。n nlogit-log5plogit-log5p对数函数对数函数(hnsh)(hnsh)法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束较明
4、显的工作曲线。法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束较明显的工作曲线。n nP P表示参数之意，由表示参数之意，由5 5个参数（个参数（S1AbsS1Abs、k k、a a、b b、c c）参与计算。）参与计算。S1AbsS1Abs表示试剂空白，表示试剂空白，K K表示校准所得斜率，表示校准所得斜率，a a表示近似常数。而使结果更加精确。表示近似常数。而使结果更加精确。n n指数函数指数函数(hnsh)(hnsh)法（法（exponentialexponential）是适用于随标准物质浓度增加，而测定的吸光度值呈现分散状态的趋势。）是适用于随标准物质浓度增加，而测定的吸光度值呈现分散状态
5、的趋势。5 5个参数（个参数（S1AbsS1Abs、k k、a a、b b、c c）n n 样条函数样条函数(hnsh)(hnsh)法（法（splinespline）：是将每一标准液测定的标准液测定的吸光度连接起来（点对点），形成一个完整曲线，即为曲线拟合。该曲线拟）：是将每一标准液测定的标准液测定的吸光度连接起来（点对点），形成一个完整曲线，即为曲线拟合。该曲线拟合优于折线法校准。由合优于折线法校准。由4 4个近似常数个近似常数a a（l l），），b b（l l）c c（l l），），d d（l l）参与计算。）参与计算。n n折线法（折线法（line Graphline Graph）：是
6、将标准液）：是将标准液1-61-6的吸光度值多用条直线连接起来的工作曲线。的吸光度值多用条直线连接起来的工作曲线。s1Abs s1Abs、k1;s2Absk1;s2Abs、k2;s2Absk2;s2Abs、k2;s3Absk2;s3Abs、k3;s4Absk3;s4Abs、k4;s5Absk4;s5Abs、k5;k5;参与计算。参与计算。第3页/共17页第四页，共17页。n nLogit-log3p适用于一点终点法、两点速率法和两点终点法等分析方法。n nlogit-log4p适用于一点终点法、两点速率法、两点终点法、三点(sn din)双项目分析法、速率法A、速率法B等分析方法。n nLog
7、it-log5p适用于一点终点法、两点速率法、两点终点法、速率A等分析方法。第4页/共17页第五页，共17页。n n样条函数法是为N也是标准被（N）有I标准液（N1）之间的范围适应于前后的测定值并使之战近，总体成为一条标准曲线，需费用(fi yong)样条函数拟合的校准方法。n n样条函数法适用第5页/共17页第六页，共17页。n n通常，生化分析仪器都设置有样品最小用量和最小体积，如日立通常，生化分析仪器都设置有样品最小用量和最小体积，如日立71707170反应体反应体积为积为180-380ul180-380ul，最大体积为，最大体积为570ul570ul，最小吸样量，最小吸样量2ul2ul
8、，在不影响结果的准确度，在不影响结果的准确度，精密度的前提下，可适当调整样品和试剂的用量。精密度的前提下，可适当调整样品和试剂的用量。n n样品与试剂的比例（样品与试剂的比例（SV/RVSV/RV），也可表示为样品分数样品体积与反应液总体），也可表示为样品分数样品体积与反应液总体积。积。n nSV/TVSV/TV是方法学基本参数，在其他参数不变时，直接影响结果的计算是方法学基本参数，在其他参数不变时，直接影响结果的计算(j(j sun)sun)。一般情况下以试剂说明为准，不宜轻易改动。一般情况下以试剂说明为准，不宜轻易改动。第6页/共17页第七页，共17页。n n如总胆固醇与甘油三脂的测定，血
9、清(xuqng)样品与试剂的最佳比列为1:100，样本的最低用量不能小于3ul。第7页/共17页第八页，共17页。n n测定方法的选择：测定方法的选择：n n自动生化仪一般都可选择一点终点法，两点速率法，速率自动生化仪一般都可选择一点终点法，两点速率法，速率A A法等。对法等。对于，一种新的实验方法，通常选择高中低尝试样本与标准于，一种新的实验方法，通常选择高中低尝试样本与标准(biozh(biozh n)n)品观察其它反应进程曲线。若均在品观察其它反应进程曲线。若均在5min5min之内呈直线，可采用速率之内呈直线，可采用速率A A测测定。如反应进程曲线不呈直线而且需定。如反应进程曲线不呈直
10、线而且需5-10min5-10min，甚至更长的时间才能达，甚至更长的时间才能达到终点，可采用两点速率法测定，如反应曲线在到终点，可采用两点速率法测定，如反应曲线在2-3min2-3min，甚至更短的，甚至更短的时间即达到终点，则采用终点法为宜。时间即达到终点，则采用终点法为宜。第8页/共17页第九页，共17页。n n同一项目可用不同的方法测定n n如血清肌酐测定通常(tngchng)的就有氧化酶和苦味酸，两点速率法和酶法的。n n当前情况下大多以使用，JAFFF法苦味酸法的，由于价格便宜，但苦味酸污染管道及比色杯。n n酶法测定肌酐价格虽然贵但其测定结果准确，试剂抗干扰力强。标本用量少，污染
11、少，有逐渐被酶法试剂盒取代的趋势。第9页/共17页第十页，共17页。n n同一个项目相同的试剂也可用不同的方法进行测定，在血清葡萄糖测定同一个项目相同的试剂也可用不同的方法进行测定，在血清葡萄糖测定方法中，己糖激酶方法中，己糖激酶HKHK法的特异性高，分析方法中有一点终点法的特异性高，分析方法中有一点终点(zhngdi(zhngdi n)n)法，两点终点法，两点终点(zhngdi(zhngdi n)n)法，速率法，速率A A法，有研究表明，三种法，有研究表明，三种分析方法中只有两点终点分析方法中只有两点终点(zhngdi(zhngdi n)n)法能扣除其光谱干扰（溶血、脂浊、法能扣除其光谱干扰
12、（溶血、脂浊、黄疸）的影响，到反应终点黄疸）的影响，到反应终点(zhngdi(zhngdi n)n)的第二点间仍能保持相对的与校的第二点间仍能保持相对的与校准曲线基本一致的曲线，其吸光度差值乃能保持原比例，因而检测结果准曲线基本一致的曲线，其吸光度差值乃能保持原比例，因而检测结果较正确。误差较小，能较好地克服（溶血、脂浊、黄疸）取得较准确的较正确。误差较小，能较好地克服（溶血、脂浊、黄疸）取得较准确的结果。结果。第10页/共17页第十一页，共17页。n n波长的选择应根据吸收光谱曲线，选择特定反应产物对吸光度吸收的最波长的选择应根据吸收光谱曲线，选择特定反应产物对吸光度吸收的最高峰值时的。波长
13、为测定波长及双单波长测定的主波长。高峰值时的。波长为测定波长及双单波长测定的主波长。n n副波长的选择原则是干扰因数在主波长与副波长有相同的吸光度或是越副波长的选择原则是干扰因数在主波长与副波长有相同的吸光度或是越接近越好，但不影响测定的灵敏度及副波长的正确选择有利于提高测定接近越好，但不影响测定的灵敏度及副波长的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差，单波长测定易受到样品溶血，黄疸，脂血等的灵敏度和减少测定误差，单波长测定易受到样品溶血，黄疸，脂血等因素的干扰，双波长测定可以通过因素的干扰，双波长测定可以通过(tnggu)(tnggu)副波长加以修正，减少甚至副波长加以修正，减少甚至消
14、除干扰因素，提高测定的准确度。消除干扰因素，提高测定的准确度。第11页/共17页第十二页，共17页。n n双波长的选择常见：双波长的选择常见：n n血红蛋白在血红蛋白在340nm340nm和和380nm380nm波长吸光度相同，波长吸光度相同，n n以以NADHNADH和和NADPHNADPH作为测定底物作为测定底物(d(d w)w)或产物的试验常用或产物的试验常用340nm340nm、380nm 340380nm 340、405405n nALPALP和和GGTGGT常用常用405nm405nm、476nm476nmn nTRINDERTRINDER反应多选取反应多选取520nm520nm、
15、600nm600nm或或550nm550nm、660nm660nmn n免疫比浊常用免疫比浊常用340nm340nm、700nm700nm等。等。第12页/共17页第十三页，共17页。n n分析时间的选择n n分析时间主要包括反应时间，监测时间（读点）和读数(dsh)间隔时间，延迟时间，根据反应类型，仪器和试剂的状况，就遵循有利于抗干扰，有足够灵敏度以及准确度的原则适当调配延迟时间和读数(dsh)时间的长短。第13页/共17页第十四页，共17页。n n定血清葡萄糖、胆固醇的试剂盒由于增加了可加快反应(fnyng)速率的工具酶的量n n3-4min反应(fnyng)完全，设置5min已足够。目前多数自动生化分析仪设置有多个反应(fnyng)时间可选（如日立7170,5min，10min，15min），须预先选定，多数仪器设定在10min左右第14页/共17页第十五页，共17页。n n监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点、监测时间（读数点）、读数间隔时间及试剂样品比例有关，要结合方法学，兼顾权衡。读数时间最理想的应选择在反应。n n反应监测时间还要考虑(kol)延迟时间的长短、测定物质的浓度范围，若监测时间多长则容易发生底物耗尽，使得测定结果偏低。第15页/共17页第十六页，共17页。第16页/共17页第十七页，共17页。