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1、会计学1酶活力测定方法酶活力测定方法 酶反应速度可以用单位时间反应底酶反应速度可以用单位时间反应底酶反应速度可以用单位时间反应底酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。物的减少或产物的增加来表示。物的减少或产物的增加来表示。物的减少或产物的增加来表示。通常酶活力测定时，先制备通常酶活力测定时，先制备通常酶活力测定时，先制备通常酶活力测定时，先制备酶反应酶反应酶反应酶反应进程曲线进程曲线进程曲线进程曲线和和和和酶浓度曲线酶浓度曲线酶浓度曲线酶浓度曲线。通过酶反应速。通过酶反应速。通过酶反应速。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。度的测定，求得酶的浓度或含量。度的测定，求得
2、酶的浓度或含量。度的测定，求得酶的浓度或含量。第1页/共23页酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。宜。第2页/共23页第3页/共23页酶活力测定的酶活力测定的要求：要求：测得的反应速测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，度必须和酶浓度
3、有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。适宜、正确的标准。第4页/共23页2 2 2 2）酶促反应的）酶促反应的）酶促反应的）酶促反应的条件条件条件条件及及及及影响因素影响因素影响因素影响因素 底物的浓度底物的浓度底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100KS=100KS=100KS=100Km m m m。pHpHpHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的
4、适宜的适宜的适宜的pHpHpHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpHpHpH。温度温度温度温度：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用25252525、30303030或或或或 37373737，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.10.10.1以内。以内。以内。以内。辅助因子辅助因子辅助因子辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相
5、应的辅酶。相应的辅酶。相应的辅酶。第5页/共23页空白和对照试验空白和对照试验空白和对照试验空白和对照试验：空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。者都加（酶预先经过失效
6、处理）。者都加（酶预先经过失效处理）。者都加（酶预先经过失效处理）。对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。第6页/共23页3 3）测定方法：）测定方法：取样测定法：取样测定法：第7页/共23页连续测定法连续测定法：在反应过程中对：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。反应系统进行直接连续检测。检测方法：检测方法：紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 旋
7、旋光法光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学电化学测定法测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电离子选择性电极测定法等。极测定法等。第8页/共23页示例：胰蛋白酶效价测定示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键水解速率：酯键酰氨键酰氨键肽键肽键供试品溶液：供试品溶液：50506060单位单位/ml/ml底物溶液：底物溶液：N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 浓度：浓度：A A：0.5750.575.0585.0585N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 N-N-苯甲酰苯甲酰-L-
8、L-精氨酸精氨酸第9页/共23页 253nm253nm253nm253nm处的处的处的处的A A A A随酶促反应递增，根随酶促反应递增，根随酶促反应递增，根随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。据酶活力单位定义计算酶活力。据酶活力单位定义计算酶活力。据酶活力单位定义计算酶活力。第10页/共23页酶活性单位酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。单位。测定测定：空白：底物溶液空白：底物溶液 +0.001mol/L HCl+0.001mol/L HCl第11页/共23页 每每每每30s A
9、30s A30s A30s A的改变：的改变：的改变：的改变：0.0150.0150.0150.0150.0180.0180.0180.018，呈线性关系的时间不得少于呈线性关系的时间不得少于呈线性关系的时间不得少于呈线性关系的时间不得少于3min3min3min3min。第12页/共23页 A A每分钟改变每分钟改变0.0030.003，相当于，相当于1 1个胰蛋个胰蛋白酶单位。白酶单位。供试液的供试液的A A每分钟改变每分钟改变第13页/共23页相当于的单位数为相当于的单位数为每每mgmg供试品中含胰蛋白酶供试品中含胰蛋白酶单位数为单位数为第14页/共23页 重组人白细胞介素重组人白细胞介
10、素 1111的胰的胰蛋白酶切肽图分析蛋白酶切肽图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构肽图分析是评价重组产品蛋白质结构肽图分析是评价重组产品蛋白质结构肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法及其生产工艺稳定性的重要方法及其生产工艺稳定性的重要方法及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用目前常用目前常用目前常用的方法有裂解的方法有裂解的方法有裂解的方法有裂解-微微微微量肽图法和胰蛋白酶切量肽图法和胰蛋白酶切量肽图法和胰蛋白酶切量肽图法和胰蛋白酶切 肽图肽图肽图肽图法法法法。第15页/共23页 1 1 1 1。酶切条件。酶切条件。酶切条件。酶切条件 取取取取浓浓浓浓度度度度为为为
11、为3 3 3 3-1-1-1-1的的的的样样样样品品品品0 0 0 0 4 4 4 4对对对对1%1%1%1%4 4 4 43 3 3 3充充充充分分分分透透透透析析析析,然然然然后后后后取取取取透透透透析析析析样样样样品品品品250250250250至至至至微微微微量量量量进进进进样样样样瓶瓶瓶瓶,加加加加0 0 0 0 3 3 3 3-1-1-1-1处处处处理理理理的的的的胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶10101010混混混混匀匀匀匀,于于于于37373737温温温温控控控控自自自自动动动动进进进进样样样样器器器器酶酶酶酶切切切切,每每每每80808080进进进进样样样样一一一一针针针针
12、,进进进进样样样样量量量量6666,用用用用32323232色色色色谱谱谱谱软软软软件件件件选选选选择择择择214214214214进进进进行行行行分分分分析析析析,直直直直至至至至 11111111完完完完全全全全酶酶酶酶解解解解。按按按按此此此此方方方方法法法法摸摸摸摸索索索索最最最最佳佳佳佳酶酶酶酶切切切切时时时时间间间间,在在在在第第第第14141414针针针针后后后后 11111111已已已已被被被被完完完完全全全全酶酶酶酶切切切切,酶酶酶酶切切切切时时时时间间间间在在在在1818181822222222范范范范围围围围内内内内肽肽肽肽图图图图图图图图谱谱谱谱基本一致基本一致基本一致
13、基本一致,即确定最佳酶切条件为即确定最佳酶切条件为即确定最佳酶切条件为即确定最佳酶切条件为37373737保温保温保温保温20202020。第16页/共23页 2 2 2 2。系统测试。系统测试。系统测试。系统测试 系系系系统统统统测测测测试试试试标标标标准准准准物物物物质质质质进进进进样样样样后后后后呈呈呈呈3 3 3 3个个个个峰峰峰峰,12,12,12,12次次次次重重重重复复复复进进进进样样样样3 3 3 3个个个个峰峰峰峰保保保保留留留留时时时时间间间间的的的的分分分分别别别别为为为为0.0.0.0.4%,0 4%,0 4%,0 4%,0.6%.6%.6%.6%和和和和0.0.0.0
14、.8%,8%,8%,8%,峰峰峰峰面面面面积积积积的的的的分分分分别别别别为为为为0 0 0 0.7%,0.7%,0.7%,0.7%,0.8%.8%.8%.8%和和和和0 0 0 0.8%.8%.8%.8%。11111111对对对对照照照照品品品品37373737酶酶酶酶切切切切20202020后后后后于于于于4444温温温温控控控控自自自自动动动动进进进进样样样样器器器器连连连连续续续续进进进进样样样样5 5 5 5次次次次,结结结结果果果果见见见见图图图图1 1 1 1。5 5 5 5个个个个色色色色谱谱谱谱图图图图完完完完全全全全重重重重叠叠叠叠在在在在一一一一起起起起,所所所所产产产产
15、生生生生21212121个个个个峰峰峰峰的的的的保保保保留留留留时时时时间间间间、峰峰峰峰高高高高和和和和峰峰峰峰面面面面积积积积的的的的均均均均分分分分别别别别小小小小于于于于1 1 1 1.0%,5.0%,5.0%,5.0%,5.4%.4%.4%.4%和和和和9.9.9.9.8%,8%,8%,8%,表表表表明明明明本本本本系系系系统统统统误误误误差差差差小小小小,重复性好重复性好重复性好重复性好,可用于可用于可用于可用于11111111的肽图分析。的肽图分析。的肽图分析。的肽图分析。第17页/共23页第18页/共23页第19页/共23页 3 3 3 3批批批批 11111111制制制制品品
16、品品的的的的 图图图图谱谱谱谱完完完完全全全全一一一一致致致致,说说说说明明明明该该该该厂厂厂厂 11111111的的的的生生生生产产产产工工工工艺艺艺艺是是是是稳稳稳稳定定定定的的的的;与与与与公公公公司司司司生生生生产产产产的的的的 11111111对对对对照照照照品品品品比比比比较较较较有有有有20202020个个个个峰峰峰峰与与与与对对对对照照照照品品品品一一一一致致致致,但但但但第第第第6 6 6 6 峰峰峰峰的的的的峰峰峰峰高高高高和和和和峰峰峰峰面面面面积积积积均均均均明明明明显显显显较较较较小小小小,且且且且在在在在第第第第9 9 9 9和和和和第第第第10 10 10 10
17、峰峰峰峰之之之之间间间间多多多多一一一一个个个个峰峰峰峰,说说说说明明明明该该该该厂厂厂厂 11111111蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构与与与与公司生产的公司生产的公司生产的公司生产的 11111111比较存在细小差别。比较存在细小差别。比较存在细小差别。比较存在细小差别。第20页/共23页返 回第21页/共23页练习与思考练习与思考1 1何何谓谓：生生化化药药物物、生生物物技技术术药药物物、基因工程药物和生物制品？基因工程药物和生物制品？2 2生生化化药药物物和和基基因因工工程程药药物物各各分分哪哪几种？几种？3 3与与化化学学合合成成药药物物的的分分析析相相比比，生生物药物的分析有何特点？物药物的分析有何特点？返 回第22页/共23页