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1、会计学1高通量测序原理高通量测序原理第1页/共16页Solexa技术介绍技术介绍n nSolexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家创立，利用专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。第2页/共16页Solexa 的基本原理第3页/共16页扩增扩增“桥”结构单链引物第4页/共16页DNA簇第5页/共16页单分子克隆单分子克隆单分子克隆单分子克隆1000 DNA片段per 1 m“DNA簇”1000“DNA簇”per 100 m square40 million clusters per experiment准备DNA片段两端接上 ada
2、pters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20 micronsSequence第6页/共16页检测检测第7页/共16页可逆终止反应可逆终止反应可逆终止反应可逆终止反应Reversible Terminator ChemistryReversible Terminator ChemistryO PPPHNNOO荧光基团3保护基团Next cycle掺入检测去保护基团 去荧光基团ODNAHNNOO3O5游离3末端XOH4种标记过的核苷酸第8页/共16页Sequencing-by-Synthesis(SBS)Sequencing-by-Synthesis(S
3、BS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA掺入一个碱基Cycle 1:加入反应体系移除其他未掺入的核苷酸信号检测Cycle 2-n:加入反应体系，循环cycle 11、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的保护基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行下一轮测序反应第9页/共16页第10页/共16页123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列通过荧光信号
4、分析核苷酸序列第11页/共16页优缺点优缺点n n高度自动化的系统n n读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profilingn n基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给从头测序（de novo sequencing）拼接带来困难第12页/共16页技术特色突出表现技术特色突出表现n n每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；n n一次实验可读取大于15 亿个碱基/芯片；n n无需建库，自动化样品制备，简单；n n实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100；n n样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测。第13页/共16页应用应用n n测序与重测序n n表达谱分析n nSmall RNA鉴定与定量n nSNP检测n nDNA甲基化分析第14页/共16页