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1、会计学1高通量测序与肿瘤课题思路高通量测序与肿瘤课题思路第1页/共42页基因基因基因基因ITIT的突破和个体化医学的突破和个体化医学的突破和个体化医学的突破和个体化医学Genetic IT&Personalized MedicineGenetic IT&Personalized Medicine基因突变和过高或过低基因表达是大多数慢性疾病发生的基因突变和过高或过低基因表达是大多数慢性疾病发生的基因突变和过高或过低基因表达是大多数慢性疾病发生的基因突变和过高或过低基因表达是大多数慢性疾病发生的分子基础分子基础分子基础分子基础（系统，规范，标准）（系统，规范，标准）（系统，规范，标准）（系统，规范
2、，标准）Genetics/Epigenetics人类估计人类估计20,000-25,000蛋白质编码基因蛋白质编码基因3 billion DNA base pairs人基因组测序人基因组测序:基因基因组数据库组数据库(&Epigenetics)人外显子组人外显子组(RNA)测测序序:基因组表达数据库基因组表达数据库(&ncRNA)个体生命特性和生物学功能个体生命特性和生物学功能正常或疾病正常或疾病-11年前完成人类基因组计划年前完成人类基因组计划让人们看到曙光，慢性病的治愈良方马上就能出现。如今，让人们看到曙光，慢性病的治愈良方马上就能出现。如今，灵丹妙药依然难求，但低成本，快速，测序海量数据
3、而新知灵丹妙药依然难求，但低成本，快速，测序海量数据而新知识正在让一部分病人受益，科技进步带来挑战，复杂的生物识正在让一部分病人受益，科技进步带来挑战，复杂的生物学也在从中作梗，给病人治愈带来难度和变数而也为技术进学也在从中作梗，给病人治愈带来难度和变数而也为技术进步确立了新的目标。步确立了新的目标。第2页/共42页基因突变和过高或过低基因表达是大基因突变和过高或过低基因表达是大多数慢性疾病发生的分子基础多数慢性疾病发生的分子基础 基因突变基因突变(DNA):基因表达的改变基因表达的改变(RNA):遗传生殖细胞突变遗传生殖细胞突变:突变的蛋白和正常蛋白表达的突变的蛋白和正常蛋白表达的改变改变.
4、单个和多个基因突变单个和多个基因突变 体细胞突变体细胞突变:突变蛋白和正常蛋白表达的改变突变蛋白和正常蛋白表达的改变 遗传单核苷酸多态性遗传单核苷酸多态性 (SNP)(SNP)感染感染 生活方式生活方式 环境等环境等第3页/共42页分子箱（分子箱（molecular bins）的概念）的概念 每一个癌症都有独特的分子异常改变。根据分子异常改变制定相应的治疗方案，每个患者对治疗的疗效也会不同。如何确定molecular bins？通过基因测序可确定分子异常改变、突变、突变谱、表观遗传异常、表达谱、甲基化谱等。摘自吴一龙点评摘自吴一龙点评ASCO2013ASCO2013肺癌肺癌-分子靶分子靶向篇向
5、篇 第4页/共42页流程图流程图细胞细胞/肿瘤黑盒肿瘤黑盒个体基因的百科全书个体基因的百科全书DNA测测序序需要特定的专业知识需要特定的专业知识/技能技能团队团队才能去理解句子才能去理解句子,段落段落,章节章节,整本基因书整本基因书?Point mutationsTruncationsInsertionFusion Cancer Genetic diseases第5页/共42页突变突变X生物生物/病理学的后果病理学的后果？治疗靶标？治疗靶标？多学科专家组成多学科专家组成的的医学基因信息分析团队医学基因信息分析团队:遗传学家遗传学家,肿瘤学家肿瘤学家,免疫学家免疫学家,医生医生,生物信息学专家生
6、物信息学专家第6页/共42页7提纲提纲肿瘤个体化诊疗背景测序技术的革命性发展新一代测序技术的临床应用检测流程第7页/共42页肿瘤个体化配药肿瘤个体化配药 肿瘤个体化配药：肿瘤个体化配药：对于每一肿瘤药物只有对于每一肿瘤药物只有1030%1030%的患者能够响应治疗。的患者能够响应治疗。但目前医生用药前无法预知哪位患者能够响应某一药物治但目前医生用药前无法预知哪位患者能够响应某一药物治疗。这一情况造成巨大浪费并耽误对患者治疗。疗。这一情况造成巨大浪费并耽误对患者治疗。2010 2010年肿瘤药物市场年肿瘤药物市场600600亿美元，由于事先不知患者是亿美元，由于事先不知患者是否对药物响应，近否对
7、药物响应，近450450亿美元的药物没有起到作用。亿美元的药物没有起到作用。协同开发个体肿瘤基因靶标预测及协同开发个体肿瘤基因靶标预测及FDAFDA药物个体化匹药物个体化匹配，建立个体肿瘤基因表达数据库找到药物敏感的标签基配，建立个体肿瘤基因表达数据库找到药物敏感的标签基因至关重要。因至关重要。目前：目前：FDAFDA批批130130多种肿瘤药物对应多种肿瘤药物对应8080多种基因靶标，多种基因靶标，有的基因靶标并无对应的药物，利用基因靶标的标签基因有的基因靶标并无对应的药物，利用基因靶标的标签基因表达谱扫描表达谱扫描FDAFDA非肿瘤药物作用于肿瘤细胞的基因表达关非肿瘤药物作用于肿瘤细胞的基
8、因表达关联谱数据库来寻找匹配药物联谱数据库来寻找匹配药物“药物新用药物新用”给给FDAFDA非肿瘤非肿瘤药物找到抗癌用途。已有成功报道。药物找到抗癌用途。已有成功报道。第8页/共42页肿瘤诊疗的进展和未来的趋势肿瘤诊疗的进展和未来的趋势 从单个基因检测到多基因检测，确立肿瘤基因型，减少对病种（组织从单个基因检测到多基因检测，确立肿瘤基因型，减少对病种（组织从单个基因检测到多基因检测，确立肿瘤基因型，减少对病种（组织从单个基因检测到多基因检测，确立肿瘤基因型，减少对病种（组织学层次）的依赖学层次）的依赖学层次）的依赖学层次）的依赖 按照突变基因组合（按照突变基因组合（patternpattern
9、）对肿瘤分型，选择适用靶向药物）对肿瘤分型，选择适用靶向药物/药物药物组合。组合。检测原癌基因、抑癌基因、检测原癌基因、抑癌基因、DNADNA错配修复基因的基因型为目前的基因错配修复基因的基因型为目前的基因检测组合。检测组合。未来：更多的基因突变未来：更多的基因突变+基因基因mRNAmRNA表达水平表达水平+甲基化甲基化+microRNA+microRNA水平水平+蛋白水平蛋白水平+的综合分型？的综合分型？off-labeloff-label用药从单基因突变型用药从单基因突变型用药从单基因突变型用药从单基因突变型/野生型到按突变野生型到按突变野生型到按突变野生型到按突变patternpatte
10、rn用药：用药：用药：用药：突变在没有突变在没有FDAFDA批下来的适用症中出现，药物有效，称为批下来的适用症中出现，药物有效，称为off-labeloff-label用用药，如贝伐单抗。药，如贝伐单抗。单一用药到复合用药：肿瘤治疗的组合用药单一用药到复合用药：肿瘤治疗的组合用药单一用药到复合用药：肿瘤治疗的组合用药单一用药到复合用药：肿瘤治疗的组合用药 多基因检测，综合性分析第9页/共42页10癌症的发生是个漫长的过程，潜伏期长达癌症的发生是个漫长的过程，潜伏期长达5-20年年癌细胞数量癌细胞数量103 106 109 1010-11 1012 第10页/共42页11形态学形态学 免疫分型免
11、疫分型 免疫球蛋白电泳免疫球蛋白电泳 免疫组化免疫组化 基因定性、定量基因定性、定量 基因突变检测基因突变检测 MSI WHO规范化肿瘤综合检测规范化肿瘤综合检测-MICM分类标准分类标准免疫学免疫学细胞遗传学细胞遗传学分子生物学分子生物学 常规病理常规病理 血细胞涂片血细胞涂片 核型分析核型分析 荧光原位杂交荧光原位杂交MICM癌症诊断的分子化侵袭性生长与转移侵袭性生长与转移宏宏 观观恶性增殖与无控生长恶性增殖与无控生长细细 胞胞遗传学表型的改变遗传学表型的改变分分 子子第11页/共42页2023/3/3121 21世纪肿瘤治疗的策略的转变世纪肿瘤治疗的策略的转变Pro.Eschenbach
12、（NCI）第12页/共42页n n免疫治疗免疫治疗n n治疗不再是仅由肿瘤位置所决定，更多的是由病人和肿瘤的基因学决定。n nASCO主席 Sandra Swainn n我们在肿瘤和免疫细胞的重要靶标上越来越有更好的目标。n nASCO癌症交流委员会主席 Bruce Roth第13页/共42页肺腺癌的驱动基因肺腺癌的驱动基因Modified from Kris M,et al.IASLC 2012 Targeted Therapies Conference.KRASEGFR未知60%19992005-2013未知25%KRASEGFRRETROS1MEKHER2METBRAFPIK3CAALK
13、NRASNTRK1第14页/共42页15Cancers,like individuals,are distincteven at the molecular level药物基因组学催生分子靶向药物细胞信号传导通路原癌基因和抑癌基因细胞因子及受体抗肿瘤血管形成自杀基因第15页/共42页通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者OSOS14家LCMC成员单位入组1102例转移性肺腺癌患者检测KRAS,EGFR,HER2,BRAF,PIK3CA,AKT1,MEK1，NRAS 突变，ALK 重排和 M
14、ET扩增1007例至少一个基因检测的患者中，622例（62%）检测到至少一个驱动基因状态的改变；733例行全部10个基因检测的患者中，465例（63%）检测到至少一个基因状态改变Johnson BE,et al.2013 ASCO Abstract 8019.LCMC Incidence of Mutation Detected第16页/共42页通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者通过驱动基因选择靶向治疗可以延长患者OSn n279279例例(28%)(28%)伴驱动基因突变患者的数据用于选择靶向治疗或入组靶向研究伴驱动基因突变患者的数据用于选择靶向治疗或入组靶向研究n n在有后续临床随访信息
15、的在有后续临床随访信息的938938例患者中，总生存分析如下：例患者中，总生存分析如下：中位生存时间(年)伴驱动突变没有接受靶向治疗的患者(n=313)伴某种驱动突变接受靶向治疗的患者(n=264)不伴驱动突变的患者(n=361)P0.0001结论：伴有已确定驱动突变的患者中，接受靶向治疗者的生存时间较未接受靶向治疗者明显延长多重基因组检测有助于临床医生选择适当的患者进行靶向治疗和入组靶向治疗临床研究Johnson BE,et al.2013 ASCO Abstract 8019.第17页/共42页NSCLC驱动基因突变谱：欧美人群驱动基因突变谱：欧美人群迄今晚期NSCLC患者中开展的规模最大
16、的生物标志物研究Barlesi F,et al.2013 ASCO Abstract 8000;Giaccone G,et al.2013 ASCO Abstract 7513.首个评估生物标志物配对治疗疗效的前瞻性临床研究第18页/共42页NSCLC腺癌基因突变谱：亚洲研究腺癌基因突变谱：亚洲研究EGFR依然是亚裔腺癌最常见的驱动基因Koh Y,et al.2013 ASCO Abstract 7572.Wu YL,et al.2011.370例中国肺腺癌201例日本肺腺癌第19页/共42页2023/3/31驱动基因指导下的驱动基因指导下的NSCLC临床研究不断深入临床研究不断深入第20页/
17、共42页Crizotinib Crizotinib 治疗治疗治疗治疗ROS1ROS1重排的晚期重排的晚期重排的晚期重排的晚期NSCLCNSCLCn n3333例例ROS1ROS1阳性阳性NSCLCNSCLC患者入组，患者入组，n n3131例接受例接受crizotinibcrizotinib治疗，治疗，n n在在2525例疗效可评价患者中例疗效可评价患者中:ORRORR为为56%56%，8 8周和周和1616周周DCRDCR为为76%76%和和60%60%。中位中位PFSPFS尚未达到，因为尚未达到，因为60%60%的患者仍在随访中，的患者仍在随访中，6 6个月个月PFSPFS率为率为71%7
18、1%。n n主要毒副作用是视觉障碍、恶心及腹泻。主要毒副作用是视觉障碍、恶心及腹泻。结论：结论：虽然该研究仍在继续，但足以说明虽然该研究仍在继续，但足以说明 crizotinib治疗治疗ROS1阳性阳性NSCLC有效。有效。Sai-Hong Ignatius Ou,et al.2013 ASCO Abstract 8032第21页/共42页22基因多态性对药物作用的影响基因多态性对药物作用的影响药代动力学药效动力学药物疗效和毒性的个体差异基因多态性药物靶点药物转运体药物代谢酶由于个体差异的存在。仅有20%40%的患者从已批准的药物中获益；70%80%的药物在临床试验中被淘汰；许多已被批准药物由
19、于毒副作用而退出市场。GT突突变变野生型野生型突变型突变型基因多态性（SNP）在人群中普遍存在；人类基因组平均每1200bp就有一个SNP。第22页/共42页不同患者不同患者相同癌症相同临床分期相同病理分级影响因素影响因素相同的药物相同的计量患者对药物反应正常患者对药物不敏感用药后产生毒副作用癌症药物治疗个体化第23页/共42页革命性的测序技术发展革命性的测序技术发展Sanger Sequencing 1977Next-Generation Sequencing 2004Ion Semiconductor Sequencing 2010The Chip is the Machine第一代测序
20、新一代测序 半导体芯片测序第24页/共42页第一代测序的局限性u操作繁琐，测序时间长u一次只能对单个基因的一个片段进行测序u样本需求量大（微克级）u背景噪音难克服，难以确认低频突变u样本中肿瘤含量要求高u价格昂贵第25页/共42页新一代测序技术新一代测序技术（nextgeneration sequencing）Roche454，Genome Sequencer FLXABI(Life)SOLiD 4 System Illumina/Solexa Hiseq 2000第二代测序技术第二代测序技术高通量高通量第26页/共42页27高通量测序加速肿瘤个体化用药进程高通量测序加速肿瘤个体化用药进程u一
21、次能对多个基因多个片段进行测序u操作自动化，测序时间短u样本需求量小（纳克级）u样本中肿瘤含量需求少u可以确认低频突变(5%)u价格低廉第27页/共42页28半导体芯片测序技术的优点半导体芯片测序技术的优点简捷简捷光学电子信号光学电子信号快速快速个小时完成测序个小时完成测序可扩展性可扩展性革命性的突破革命性的突破第28页/共42页样本采集样本采集血血/组织组织/FFPE 提提取取DNA /RNA 建建 库库 模模板板 制制备备 测序测序 /验证验证Sh生物信息学分析生物信息学分析医学信息分析医学信息分析 报告报告 生成生成检测流程检测流程缺一不可缺一不可/个体化分析个体化分析深度分析深度分析初
22、步分析初步分析药物药物反应反应疾病疾病风险风险肿瘤肿瘤突变突变三大支撑团队：技术，信息，医学第29页/共42页肿瘤样本肿瘤样本测序测序肿瘤基因肿瘤基因突变突变基因多态性基因多态性分析分析肿瘤突变谱肿瘤突变谱基因多态性基因多态性个体化个体化肿瘤肿瘤治疗指导治疗指导石蜡包埋组织切片或组织块新鲜冰冻组织血液和骨髓其他检测流程第30页/共42页肿瘤个体化用药基因检测报告肿瘤个体化用药基因检测报告第31页/共42页肿瘤个体化用药基因检测报告第32页/共42页肿瘤个体化用药基因检测报告第33页/共42页VEGF损伤修复基因损伤修复基因MDM2反馈调节反馈调节p21切断肿瘤血供切断肿瘤血供GD-AIFBAI
23、-1TSP血管生成因子血管生成因子抗血管生成因子抗血管生成因子p53Ku70 DNA-PK ATM 逆转放疗抗性逆转放疗抗性MDR逆转化疗抗性逆转化疗抗性细胞周期阻滞细胞周期阻滞MMP抑制肿瘤浸润转移抑制肿瘤浸润转移NK旁杀伤效应旁杀伤效应a(II)PH细胞凋亡细胞凋亡促进作用促进作用抑制作用抑制作用Ad-p53多途径抗癌多途径抗癌第34页/共42页贝伐单抗在宫颈癌的第一项报告贝伐单抗在宫颈癌的第一项报告n n一项来自Gynecologic Oncology Group协作组的III期随机临床试验，评估贝伐单抗联合 顺铂、紫杉醇、拓扑替康 等药物化疗对复发和转移性宫颈癌的疗效。结果表明：这项试
24、验首次发现靶向药物可以显著改善妇科肿瘤的总体生存状况。贝伐单抗联合 顺铂、紫杉醇、拓扑替康 等药物化疗 可延长患者中位生存期4个月，具有显著的临床获益。第35页/共42页贝伐单抗贝伐单抗治疗新诊断胶质母细胞瘤治疗新诊断胶质母细胞瘤的的III期双盲安慰剂对照试验。期双盲安慰剂对照试验。结论：新诊断的GBM 使用BEV并没有改善OS，数据显示虽然PFS有所提高，但没有达到显著性标准。考虑到II期临床试验的显著疗效，专家在解读这一结果是认为，应当尝试检验贝伐单抗与其他药物联用的疗效。第36页/共42页n n通过高通量检测所获得的数据撰写的2篇ASCO投稿均被录用。相应的2篇文章均在cancer research review。另有一篇已被plos one 接收，一篇nature community review。n n大连第一附属医院耳鼻喉科作为辽宁省耳聋筛查指定2家医院之一，通过与我们耳聋基因筛查合作，成功将耳聋病人基因筛查率由现有20%提高到40%多，并合作研发的新的方案可提高到70%。相应的辽宁省另一指定医院盛京医院耳鼻喉科已主动接触，争取对我们院外送样检测。2023/3/31第37页/共42页