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1、会计学1酶类药物及其生产工艺酶类药物及其生产工艺第1页/共10页1 1、L-L-天门冬酰胺酶工艺路线天门冬酰胺酶工艺路线第2页/共10页L-天门冬酰胺酶工艺说明天门冬酰胺酶工艺说明 菌种培养菌种培养 大肠杆菌大肠杆菌37培养培养24h普通牛肉培养普通牛肉培养基基;种子培养种子培养 16玉米浆，接种量玉米浆，接种量 1 1.5，37，通气搅拌培养，通气搅拌培养 48h;发酵罐培养发酵罐培养 玉米浆培养基，接种量玉米浆培养基，接种量 8，37通气搅拌培养通气搅拌培养 6 8h，离心分离发酵液，得菌体，离心分离发酵液，得菌体，加加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛
2、，自然风干成菌体干粉菌体干粉;第3页/共10页提取、沉淀、热处理每千克菌提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入体干粉加入0.01 mol/LpH8的硼酸的硼酸缓冲液缓冲液10L37搅拌搅拌1.5h，308mol/L醋酸调节醋酸调节pH4.24.4，压滤，滤液加入，压滤，滤液加入2倍体积的丙酮，倍体积的丙酮，放置放置34h过滤，收集沉淀，自然过滤，收集沉淀，自然风干，得干粗酶。风干，得干粗酶。取粗制酶，加入取粗制酶，加入03甘氨酸，调节甘氨酸，调节pH8.8搅拌搅拌1.5h离心，上清液离心，上清液6030min热处理。上清液加热处理。上清液加 2倍倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，体积的丙酮，析出沉淀
3、，离心，收集酶沉淀，收集酶沉淀，0.01mol/L，pH8磷磷酸缓冲液溶解，离心得上清酶溶酸缓冲液溶解，离心得上清酶溶液。液。第4页/共10页精制、冻干精制、冻干 调节调节pH8.8离心弃去沉淀，离心弃去沉淀，清液再调清液再调 pH7.7加入加入50聚乙二醇，浓度聚乙二醇，浓度达到达到 16。2 5放置放置 4 5天，离心天，离心得沉淀。蒸馏水溶解加得沉淀。蒸馏水溶解加 4倍量的丙酮沉淀，倍量的丙酮沉淀，同法反复同法反复 1次，次，pH6.4,0.05mol/L磷酸缓冲磷酸缓冲液溶解，液溶解，50聚乙二醇处理聚乙二醇处理 1次，即得无次，即得无热原的热原的 L一天门冬酸胺酶。溶于一天门冬酸胺酶
4、。溶于 0.8mol/L磷酸缓冲液，在无菌条件下用磷酸缓冲液，在无菌条件下用 6号垂熔漏号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用 L一一天门冬酸胺酶成品，每天门冬酸胺酶成品，每I支支 1万或万或 2万单位。万单位。第5页/共10页二、细胞色素二、细胞色素C生产工艺生产工艺临床上主要用于组织缺氧的急救和辅助治疗药物，临床上主要用于组织缺氧的急救和辅助治疗药物，适用于治疗脑、心肌缺氧和其它因缺氧引起的一切适用于治疗脑、心肌缺氧和其它因缺氧引起的一切症状。症状。第6页/共10页工艺过程绞碎、提取、压滤绞碎、提取、压滤 取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机取新
5、鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机中绞碎。称取心肌碎肉，加中绞碎。称取心肌碎肉，加1.5倍量蒸馏水搅拌均匀，倍量蒸馏水搅拌均匀，用硫酸调用硫酸调pH4左右，常温搅拌提取压滤，滤液用氨水左右，常温搅拌提取压滤，滤液用氨水调节调节pH6.2，离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水同上离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水同上法重复提取法重复提取1次，合并两次提取液。次，合并两次提取液。中和、吸附、洗脱中和、吸附、洗脱提取液加氨水中和至提取液加氨水中和至pH7.5，在冰箱中静止沉淀杂蛋白，在冰箱中静止沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸人造沸石，搅拌
6、吸附附40min，静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素 C的人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后的人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后装柱，用装柱，用 25硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。第7页/共10页盐析、浓缩、透析盐析、浓缩、透析 洗脱液洗脱液加入固体硫酸镀达到加入固体硫酸镀达到 45饱和度，使杂蛋白析出，过饱和度，使杂蛋白析出，过滤。收集透明滤液，缓缓加滤。收集透明滤液，缓缓加入入 20三氯醋酸，边加边搅三氯醋酸，边加边搅拌使细胞色素拌使细胞色素 C沉淀析出，沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀溶离心收集沉淀。再将沉淀溶于
7、蒸馏水，装入透析袋中，于蒸馏水，装入透析袋中，透析至无硫酸根为止，过滤透析至无硫酸根为止，过滤得细胞色素得细胞色素C粗品溶液。粗品溶液。第8页/共10页吸附、洗脱、透析吸附、洗脱、透析粗品溶液通过处理好的粗品溶液通过处理好的 Amberite IRC50（NH4）树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，水洗至澄清树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，水洗至澄清为止，再分别上柱，用为止，再分别上柱，用06mol/L磷酸氢二钠与磷酸氢二钠与0.4mol/L氯化钠混合液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析去氯离子，氯化钠混合液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析去氯离子，得细胞色素得细胞色素C精品溶液。精品溶液。制剂制剂取含相当于取含相当于1.5g的细胞色素的细胞色素C精品液，加精品液，加200mg亚硫酸亚硫酸氢钠，搅拌溶解再加双甘肽氢钠，搅拌溶解再加双甘肽1.5g混合均匀，用氢氧化混合均匀，用氢氧化钠调节钠调节pH6.4左右，加注射用水左右，加注射用水100ml，过滤除热原，过滤除热原，6号垂溶漏斗过滤，测含量，灌注，冷冻干燥，即得每号垂溶漏斗过滤，测含量，灌注，冷冻干燥，即得每支含支含15mg细胞色素细胞色素C的制剂。的制剂。第9页/共10页