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1、会计学1细胞转染技术细胞转染技术一一一一 ：转染的简介：转染的简介：转染的简介：转染的简介二二二二 ：转染的分类：转染的分类：转染的分类：转染的分类三：三：三：三：转染的方法转染的方法转染的方法转染的方法第1页/共20页一一一一 、转染的简介转染的简介转染的简介转染的简介1.1.1.1.基因转染基因转染基因转染基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。生物功能。生物功能。生物功能。2.2
2、.2.2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。第2页/共20页二二二二 、转染的分类、转染的分类、转染的分类、转染的分类瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染目的目的快速分析快速分析为获得稳定表达为获得稳定表达外源基因的单细外源基因的单细胞克隆胞克隆 目的目的DNADNA与宿主染与宿主染色体色体未整合未整合整合整合表达持续时间表达持续时间随细胞分裂而稀随细胞分裂而稀释至丢失释至丢失48487272小时小时 随宿主细胞本身随
3、宿主细胞本身基因组一样复制，基因组一样复制，转录，翻译，并转录，翻译，并被稳定遗传被稳定遗传 筛选办法筛选办法抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性第3页/共20页基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法第4页/共20页 是是最最早早应应用用哺哺乳乳动动物物细细胞胞转转染染的的试试剂剂之之一一。DEAE-DEAE-葡葡聚聚糖糖是是阳阳离离子子多多聚聚体体,它它与与带带负负电电的的核核酸酸结结合合后后接接近近细细胞胞膜膜而而被被摄摄取取。DEAEDEAE一一葡葡聚聚糖糖转转染染已已成成功功地地应应用用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。于瞬时开始
4、，但用于稳定转染却不可靠。DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-葡聚糖法葡聚糖法葡聚糖法葡聚糖法第5页/共20页磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由由由由于于于于试试试试剂剂剂剂易易易易得得得得、价价价价格格格格便便便便宜宜宜宜而而而而被被被被广广广广泛泛泛泛用用用用于于于于瞬瞬瞬瞬时时时时转转转转染染染染和和和和稳稳稳稳定定定定染染染染的的的的研研研研究究究究。方方方方法法法法是是是是，先先先先将将将将DNADNADNADNA和和和和氯氯氯氯化化化化钙钙钙钙混混混混合合合合，然然然然后后后后加加加加人人人人到到到到PBSPBSPBSPBS中中中中慢慢
5、慢慢慢慢慢慢形形形形成成成成DNADNADNADNA磷磷磷磷酸酸酸酸钙钙钙钙沉沉沉沉淀淀淀淀，后后后后把把把把含含含含有有有有沉沉沉沉淀淀淀淀的的的的混混混混悬悬悬悬液液液液加加加加到到到到培培培培养养养养的的的的细细细细胞胞胞胞上上上上，通通通通过过过过胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的内内内内吞吞吞吞作作作作用摄人用摄人用摄人用摄人DNADNADNADNA。第6页/共20页脂质体介导法（目前应用最广泛）脂质体介导法（目前应用最广泛）脂质体介导法（目前应用最广泛）脂质体介导法（目前应用最广泛）原理：阳离子脂质体试剂与原理：阳离子脂质体试剂与原理：阳离子脂质体试剂与原理：阳离子脂质体试剂与DNADNAD
6、NADNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNADNADNADNA被被被被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，附到细胞表面并与细胞膜融合，附到细胞表面并与细胞膜融合，附到细胞表面并与细胞膜融合，DNADNADNADNA被释放
7、到胞浆中。被释放到胞浆中。被释放到胞浆中。被释放到胞浆中。第7页/共20页n n此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。粒进入细胞的一般过程。粒进入细胞的一般过程。粒进入细胞的一般过程。第8页/共20页【主要应用主要应用主要应用主要应用】:瞬时转染瞬时转染瞬时转染瞬时转染 稳定转染稳定转染稳定转染稳定转染.【特点特点特点特点】：使用方法简单，可携带大片段：使用方法简单，可携带大片段：使用方法简单，可携带大片段：使用方法简单
8、，可携带大片段DNADNA，通用于各种类型的裸露，通用于各种类型的裸露，通用于各种类型的裸露，通用于各种类型的裸露DNADNA或或或或RNARNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反的效率，
9、但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。第9页/共20页 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重细胞密度以及转染的时间长短
10、和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。第10页/共20页物理方法物理方法物理方法物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪电穿孔、显微注射及基因枪电穿孔、显微注射及基因枪电穿孔、显微注射及基因枪)（1 1 1 1）电穿孔法）电
11、穿孔法）电穿孔法）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染地用于悬浮细胞，
12、重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。第11页/共20页(2(2(2(2）显微注射法）显微注射法）显微注射法）显微注射法 该该该该法法法法虽虽虽虽然然然然费费费费力力力力，但但但但却却却却是是是是非非非非常常常常有有有有效效效效的的的的将将将
13、将核核核核酸酸酸酸导导导导人人人人细细细细胞胞胞胞或或或或细细细细胞胞胞胞核核核核的的的的方方方方法法法法。这这这这种种种种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。（3 3 3 3）基因枪法）基因枪法）基因枪法）基因枪法 该该该该法法法法依依依依靠靠靠靠携携携携带带带带了了了了核核核核酸酸酸酸的的的的高高高高速速速速粒粒粒粒子子子子而而而而将将将将核核核核酸酸酸酸导导导导人人人人细细细细胞胞胞胞内
14、内内内，这这这这种种种种方方方方法法法法适适适适用用用用于于于于培培培培养的细胞和在体的细胞。养的细胞和在体的细胞。养的细胞和在体的细胞。养的细胞和在体的细胞。第12页/共20页实验室用到的转染方法实验室用到的转染方法脂质体介导法脂质体介导法第13页/共20页细胞转染细胞转染Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000转染试剂：以转染试剂：以HEK193HEK193细胞为例：细胞为例：n n转染前一天，将细胞铺到培养皿中，转染前一天，将细胞铺到培养皿中，n n加入有血清无双抗的培养基（加入有血清无双抗的培养基（15ml15ml）；）；n n2424小时候换上无血清无
15、双抗的培养基小时候换上无血清无双抗的培养基12ml12ml；n n将所需的质粒用将所需的质粒用1.5ml1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取无血清无双抗的培养基稀释；取40ul40ul的的Lipofectamine Lipofectamine 20002000加入无血清无双抗的培养基稀释，室温放置加入无血清无双抗的培养基稀释，室温放置5min5min；n n5min5min后将质粒和后将质粒和Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000混合在一起，室温放置混合在一起，室温放置20min20min后加入培养后加入培养皿中，皿中，4h4h后换上完全培养基后换上完全培养
16、基48h48h培养；培养；注：注：注：注：24h24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；看一次，如果培养基变颜色换培养基；第14页/共20页转染的影响因素转染的影响因素第15页/共20页 细细胞胞（1 1 1 1）分裂细胞相比较非分裂细胞）分裂细胞相比较非分裂细胞）分裂细胞相比较非分裂细胞）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2 2 2 2）贴壁细胞相比较悬浮细胞）贴壁细胞相比较悬浮细胞）贴壁细胞相比较悬浮细胞）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3 3 3 3）传代次数）传代次数）传代次数）传代次数 （4 4 4 4）细胞数量（融合率）细胞数量（融合率）细胞数量（融合率）细胞数量（融合率）第16页/共20页2
17、 2 2 2 交叉污染交叉污染交叉污染交叉污染n n如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLaHeLaHeLaHe
18、La细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。取代目标培养物。取代目标培养物。取代目标培养物。第17页/共20页3
19、 3 3 3 载体载体载体载体DNADNADNADNA 对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。能的载体
20、做对照。能的载体做对照。能的载体做对照。（1 1）载体完整性）载体完整性）载体完整性）载体完整性（2 2）载体制备物）载体制备物）载体制备物）载体制备物第18页/共20页4 4 4 4 组织培养试剂组织培养试剂组织培养试剂组织培养试剂一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。能减少所用试剂的变更。能减少所用试剂的变更。能减少所用试剂的变更。(1)(1)(1)(1)基础培养基基础培养基基础培养基基础培养基 (2)(2)(2)(2)胎牛血清胎牛血清胎牛血清胎牛血清 (3)(3)(3)(3)添加剂添加剂添加剂添加剂 第19页/共20页