《细胞转染技术优秀PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞转染技术优秀PPT.ppt（20页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、细胞转染技术一一：转染的简介：转染的简介二二：转染的分类：转染的分类三：三：转染的方法转染的方法一一、转染的简介转染的简介1.1.基因转染基因转染:将具生物功能的核酸转移或运输到细胞内并将具生物功能的核酸转移或运输到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。使核酸在细胞内维持其生物功能。2.2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能探讨和基因治基因转染技术已广泛应用于基因组功能探讨和基因治疗探讨。疗探讨。二二 、转染的分类、转染的分类瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染目的目的快速分析快速分析为获得稳定表达为获得稳定表达外源基因的单细外源基因的单细胞克隆胞克隆 目的目的DNADNA与宿主染与宿主染色体色体
2、未整合未整合整合整合表达持续时间表达持续时间随细胞分裂而稀随细胞分裂而稀释至丢失释至丢失48487272小时小时 随宿主随宿主细细胞本身胞本身基因基因组组一一样样复制，复制，转录转录，翻，翻译译，并，并被被稳稳定定遗传遗传 筛选办法筛选办法抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法转染方转染方 法法化学化学 转染法转染法物理物理 转染法转染法病毒病毒 感染法感染法DEAE一一葡聚糖法葡聚糖法显微显微注射法注射法逆转录病毒逆转录病毒磷酸钙法磷酸钙法电穿孔法电穿孔法腺病毒腺病毒人工人工脂质体法脂质体法基因枪法基因枪法 是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。
3、DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时起先，但用于稳定转染却不行靠。DEAE-DEAE-葡聚糖法葡聚糖法磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由由于于试试剂剂易易得得、价价格格便便宜宜而而被被广广泛泛用用于于瞬瞬时时转转染染和和稳稳定定染染的的探探讨讨。方方法法是是，先先将将DNADNA和和氯氯化化钙钙混混合合，然然后后加加人人到到PBSPBS中中渐渐渐渐形形成成DNADNA磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，后后把把含含有有沉沉淀淀的的混混悬悬液液加加到到培培育育的的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNA
4、DNA。脂质体介导法（目前应用最广泛）脂质体介导法（目前应用最广泛）原理：阳离子脂质体试剂与原理：阳离子脂质体试剂与DNADNA混合后，形成一种稳定的混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，脂质双层复合物，DNADNA被包在脂质体中间，这种脂质双被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可干脆加到培育的细胞中，脂质体粘附到细层复合物可干脆加到培育的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，胞表面并与细胞膜融合，DNADNA被释放到胞浆中。被释放到胞浆中。n此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。进入细胞的一般过程。【主要
5、应用】【主要应用】:瞬时转染瞬时转染 稳定转染稳定转染.【特点】：运用方法简洁，可携带大片段【特点】：运用方法简洁，可携带大片段DNA，通用于，通用于各种类型的袒露各种类型的袒露DNA或或RNA，能转染各种类型的细胞，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发猛烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应猛烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。用受限制。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因利用脂质体转染法最重要
6、的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培育基中血清的含量都是影响转染效率的重要问短和培育基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过试验摸索的合适转染条件对于效率的提高有题，通过试验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。巨大的作用。物理方法物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪电穿孔、显微注射及基因枪)（1 1）电穿孔法）电穿孔法 利利用用高高压压电电脉脉冲冲对对细细胞胞膜膜的的干干扰扰，使使其其形形成成利利于于核核酸酸进进人人的的微微孔孔。电电穿穿孔孔技技术术可可用用于于瞬瞬时时转转染染和和稳稳定定转转染染，
7、可可便便利利地地用用于于悬悬浮浮细细胞胞，重重现现性性好好，但但须须要要较较多多的的细细胞胞。影影响响转转染染效效率率的的主主要要因因素素是是脉脉冲冲强强度度和和持持续续时时间间。必必需需找找到到能能够够使使核核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。(2(2）显微注射法）显微注射法 该该法法虽虽然然费费劲劲，但但却却是是特特别别有有效效的的将将核核酸酸导导人人细细胞胞或或细细胞胞核核的的方方法法。这这种种方方法法常常用用来来制制备备转转基基因因动动物物，但不适用于须要大量转染细胞的探讨。但不适用于须要大量转染细胞的探讨。（3 3）基因枪法）基因枪法 该该法
8、法依依靠靠携携带带了了核核酸酸的的高高速速粒粒子子而而将将核核酸酸导导人人细细胞内，这种方法适用于培育的细胞和在体的细胞。胞内，这种方法适用于培育的细胞和在体的细胞。试验室用到的转染方法脂质体介导法脂质体介导法细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞为例：转染前一天，将细胞铺到培育皿中，加入有血清无双抗的培育基（15ml）；24小时候换上无血清无双抗的培育基12ml；将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培育基稀释；取40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培育基稀释，室温放置5min；5min后将质粒和Lipofectamine 200
9、0混合在一起，室温放置20min后加入培育皿中，4h后换上完全培育基48h培育；注：24h看一次，假如培育基变颜色换培育基；转染的影响因素转染的影响因素 细胞细胞（1 1）分裂细胞相比较非分裂细胞）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2 2）贴壁细胞相比较悬浮细胞）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3 3）传代次数）传代次数 （4 4）细胞数量（融合率）细胞数量（融合率）2 2 交叉污染交叉污染n假犹如一个试验室同时培育不同种类的细胞，那就有假犹如一个试验室同时培育不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分别操作规程可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分别操作规程这种状况也有可能发生。如有很多细
10、胞系被这种状况也有可能发生。如有很多细胞系被HeLaHeLa细胞细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发觉。假如有少量某种生长快速的细胞掺入到培镜检发觉。假如有少量某种生长快速的细胞掺入到培育细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培育物。育细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培育物。3 3 载体载体DNADNA 对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，确定要选用一种已知具有功能的细胞体系的参数时，确定要选用一种已知具有功能的载体做比照。载体做比照。（1）载体完整性）载体完整性（2）载体制备物）载体制备物4 4 组织培育试剂组织培育试剂一般原则：优化您的细胞生长条件。只运用簇新配制的一般原则：优化您的细胞生长条件。只运用簇新配制的培育基和添加剂，并尽可能削减所用试剂的变更。培育基和添加剂，并尽可能削减所用试剂的变更。(1)(1)基础培育基基础培育基 (2)(2)胎牛血清胎牛血清 (3)(3)添加剂添加剂