《体内药物分析教程.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《体内药物分析教程.pdf（23页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第一部分第一部分 概述概述体内药物分析是对体内样本（包括生物体液、器官或组织）中的药物、代谢物或内源性物质的定量分析。体内药物分析是药代动力学研究和治疗药物监测（TDM）的重要手段.药物在临床前研究阶段,首先在试验动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究；在临床研究阶段，要对药物作用于人体的安全性与有效性作出评价.这些研究中，建立有效的体内药物分析方法是首要任务.随着现代医学的不断进步,精准医疗和个体化治疗成为新的理念.TDM 就是采用灵敏可靠的方法，检测患者体内的药物浓度，指导个体化用药方案的制定，保证用药的有效性与安全性。另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有
2、重要意义；对于麻醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成.药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位,因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要;机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关.所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物
3、活性物质也是体内药物分析的目标。在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理进行分离净化与浓集等样品前处理,从而为体内样品中药物的测定提供从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件良好的环境与条件.体内样品大都具有以下性质特点：采样量少，采样量一般为数毫升至数十微升，且在特定条件下采集，不易重新获得.待测物浓度低,通常在 10-910-6g/ml 级，甚至低至 10-12g/ml。干扰物质多，血样中干扰物质多，血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物和含有蛋白质、
4、脂肪、尿素等有机物和NaNa+、K K+等大量内源性物质通常对等大量内源性物质通常对测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合,也能干扰测定也能干扰测定.因此，体内药物分析的特点是:体内样品需经分离与浓集体内样品需经分离与浓集,或经适或经适当的处理后才能进行分析当的处理后才能进行分析;对分析方法的灵敏度及专属性要求较高；对分析方法的灵敏度及专属性要求较高；分析工作量大，测定数据的处理和结果的阐明繁琐费时。分析工作量大，测定数据的处理和结果的阐明繁琐费时。生 物 样 本 中 所 含 药 物 或 其 特 定 代 谢 产 物 的 浓 度 大 多 较 低（
5、10-10106g/ml），且难以通过增加体内样品量提高方法灵敏度。目前，体内药物分析常用的检测方法主要有色谱分析法、免疫分析法和生物学方法。1.色谱分析法 主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等，可用于大多数小分子药物的体内检测。目前色谱分析法，尤其是 HPLCHPLC 及其联用技术及其联用技术 LCLCMSMS 与与 LCLCMSMSMSMS 已经成为体内样已经成为体内样品中药物及其代谢产物分析检测的首选方法，品中药物及其代谢产物分析检测的首选方法，并逐步应用于蛋白质、多肽等生物大分子类药物或内源性物质的检测与分析.2。免疫分析法 主要有放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析
6、法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA)等，多用于蛋白质、多肽等生物大分子类物质的检测。3.生物学方法 微生物学方法常能反映药效学的本质,可用于抗生素类药物的体内分析.但生物学方法一般特异性较差，常需采用特异性高的方法（如色谱分析法）进行平行监测.第二部分第二部分 体内样品的制备与贮藏体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类一、体内样品的种类体内样品包括各种体液与组织。但是，在体内药物分子中最为常用在体内药物分子中最为常用的样本是血液的样本是血液,它能较为准确地反应药物在体内的状况它能较为准确地反应药物在体内的状况。尿液中含有丰富的药物代谢物,也被较多地使用。唾液因采集便利且有时与血浆游离药物浓度
7、具有相关性而时有使用。而脏器组织，除非特别需要，在治疗药物监测（TDM)中很少使用.二、体内样品的采集与制备二、体内样品的采集与制备（一）血样（一）血样血样包括全血（血样包括全血（whole bloodwhole blood）、血浆（血浆（plasmaplasma）和血清（）和血清（serum),serum),是是最为常用的体内样品。最为常用的体内样品。血药浓度检测，除非特别说明外,通常指血浆或血清的药物浓度测定.当药物在体内达到稳态状态时，当药物在体内达到稳态状态时，血浆中药物浓度能够血浆中药物浓度能够反应药物在靶器官的状况反应药物在靶器官的状况,因而血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可因而血
8、浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。靠指标。1全血的采集 人体采血，通常采集静脉血，有时从毛细血管采血（成人多从手指或耳垂取血，小儿多从脚趾取血）用于临床化验。根据分析方法灵敏度的要求，一般每次采血量 15ml；动物实验时，可直接从动脉或心脏取血.全血采集后,置含有抗凝剂（肝素、EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等）的试管中,混合均匀，但不经离心操作,保持血浆和血细保持血浆和血细胞处于均相，即为全血样品。胞处于均相，即为全血样品。2血浆的制备 将采集的全血置含有抗凝剂的试管中,混匀后，以约1000g 离心力,离心 510 分钟，促进血红细胞沉降分离，所得淡黄色上清液即为血浆。最常用的抗凝剂是肝素（
9、heparin)。肝素是体内正常生理成分,因此不致改变血样的化学组成或引起药物的变化,一般不会干扰药物的测定.3.血清的制备 采集的全血不加抗凝剂采集的全血不加抗凝剂，室温放置至少 30 分钟1 小时，待血液凝固后，以约1000g 离心力，离心1020 分钟,上层淡黄色澄清液体即为血清。在凝血过程中,纤维蛋白原转变成纤维蛋白块,所以血清中无纤维蛋白原。因药物与纤维蛋白几乎不结合，所以血浆与血清中的药物浓度通常是相同的。作为血药浓度测定的样品，血浆和血清可任意选用。但无论是采用血浆还是血清，现有的文献、资料所列的血药浓度，均系指血浆或血清中药物的总浓度（游离+与血浆蛋白结合）.血浆比血清分离得快
10、，而且制取的量约为全血的50%60（血清只为全血的 2040%），多数研究者使用血浆。若血浆中含有的抗凝若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。若需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则应使用全血样品；某些情况下由于血浆内药物浓度波动太大,且又难以控制，或因血浆药物浓度很低而影响测定，也应考虑使用全血样品。如:氯噻酮可与红细胞结合,在血细胞中的药物浓度比血浆中药物浓度大 50100 倍,且其动力学行为亦与在血浆中不同,因此宜用全血样品测定。（二）尿样（二）尿样体内药物清除主要通过肾脏排泄，经尿液排出。尿药测定主要用于药物的
11、剂量回收、尿清除率研究。同时，当药物在血中浓度过低难以准确测定时，尿药测定亦用于药物制剂的生物利用度研究，以及根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型等.尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色的，pH 在 4.88.0 之间。放置后会析出盐类,并有细菌繁殖、固体成分的崩解使尿液变混浊。因此，尿液采集后如不能立即测定，需低温冰冻保存或加入防腐剂后冷藏保存。常用的防腐剂常用的防腐剂有二甲苯、三氯甲烷、醋酸、盐酸等有二甲苯、三氯甲烷、醋酸、盐酸等.保存时间为保存时间为 24362436 小时，可置冰小时，可置冰箱（箱（4 4）中；长时
12、间保存时，应冰冻（）中；长时间保存时，应冰冻（2020或或80708070)。体内药物的清除可能以原形（母体药物）或代谢物及其缀合物等形式排出.尿液中药物浓度大都较高，收集量可以很大（成人一日排尿量为15L)。但由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，常使尿药浓度变化较大，故测定尿液中药物浓度时，一般采用 时间尿时间尿（一定时间区间的尿液），以某一时间段或单位时间内尿中药物的总量（排泄量或排泄率）表示。测定尿液中药物的总量时，应收集服药后一定时间内(如 24 小时）各时间段排泄的全部尿液,记录体积；量取一部分测定尿液药物浓度，乘以尿液量，计算尿药排泄总量。（三）唾液（三）唾液一些药物的唾液
13、浓度与血浆游离浓度呈现密切相关，因此在 TDM工作中有可能利用测定唾液中药物浓度进行临床监测.另外，唾液样品也可用于药物动力学的研究.唾液是由腮腺、舌下腺和颌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成的混合液体。正常成年人唾液分泌量每天约为11.5L。唾液的 pH 为 6。27。4,当分泌增加时，pH 会更高。唾液的采集一般在漱口后约 15 分钟进行，应尽可能在刺激少的安静状态下收集口腔内自然流出的唾液。唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分成泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三层.以 3000 r/min 离心 10 分钟，取上清液作为药物浓度测定的样品.唾液应在 4以下保存，冷冻保
14、存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差。（四）组织（四）组织在药物的动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器组织中的分布情况可为药物的体内动力学过程提供重要信息.常用的脏器组织有：胃、肝、肾、肺、心、脑等脏器及其他组织。体内各种脏器组织样品在测定之前，首先需均匀化制成水性基质匀水性基质匀浆溶液浆溶液，然后再用适当方法萃取药物然后再用适当方法萃取药物。匀浆化操作系将组织样品中加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使待测药物释放、溶解,分取上清液测定。第三部分第三部分 体内样品的前处理体内样品的前处理去除蛋白和液去除蛋白和液-液萃取法
15、液萃取法在测定体内药物及其代谢物时，除少数情况将体液作简单处理后直接测定外,一般在测定之前要对样品进行适当的预处理，为药物的测定创造良好条件.样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难，难，最繁复的工作最繁复的工作.由于药物自身的理化特性和存在形式以及生物介质的差异，对于体内样品的预处理很难规定统一方法和固定的程序，而必须结合后续的测定方法对分析样品的要求，采取恰当的预处理步骤。一、体内样品预处理的目的一、体内样品预处理的目的1、使待测药物游离使待测药物游离 药物进入体内后，即与血浆蛋白结合，同时部分经生物转化生成代谢
16、物及缀合物。通过预处理，使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来，以便测定药物或代谢物的总浓度。2、满足测定方法的要求 体内样品介质组成复杂、干扰多，而待测药物组分浓度低。因此，需将样品进行适当处理,使组分得到净化和富集,以满足测定方法对分析样品的要求.3、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度和选择性等。如采用 HPLC 法测定，为防止蛋白质在色谱柱上的沉积、堵塞，需要除去血浆蛋白质。预处理不仅可以延长色谱柱的寿命，也可以改善方法的选择性（排除生物介质的干扰）和组分的可测性或组分的色谱行为。二、常用体内样品预处理方法二、常用体内样品预处理方法常用体内样品的预处理方法一般有蛋白沉淀法
17、、液-液萃取法、液固萃取法.特殊情况下需进行缀合物水解、化学衍生化等。（一）蛋白沉淀法（一）蛋白沉淀法在测定血样时，首先应去除蛋白质.去除蛋白质可使结合型的药物释放出来,以便测定药物的总浓度。去除蛋白法有以下几种方法.1、溶剂沉淀法 加入与水相混溶的有机溶剂（亲水性有机溶剂），蛋白质分子间的静电引力增加而聚集。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为 1：（23）时，可以将 90以上的蛋白质除去.上清液偏碱性，pH 为 8.59。5。操作时,将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离，取上清液作为供试溶液。通常用于分离血浆或血清的离心力(
18、约1000g）不能将蛋白质沉淀完全，而采用高速离心（离心力约15000g)约 5 分钟便可将析出的蛋白质沉淀完全。2、中性盐析法 加入中性盐,溶液的离子强度发生变化,部分蛋白质的电性被中和，蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚。常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。操作时,按血清与饱和盐溶液的比例为 1：（23)混合，高速离心约 2 分钟，即可除去 90%以上的蛋白质。所得上清液近中性，pH 为 7。07。7.3、强酸沉淀法 当溶液 pH 低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有 10%三氯醋酸或 6高氯酸溶液。含药物血清
19、与强酸的比例为10.6 混合，高速离心约 2 分钟，就可以除去 90以上的蛋白质.因加入了强酸，上清液呈强酸性（pH 04)，在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白.4、热凝固法 当待测物热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定,通常可加热至90.蛋白沉淀后可用离心或过滤法除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。（二（二)液液-液萃取法（液萃取法（liquidliquidliquid extractionliquid extraction，LLE)LLE)液-液萃取法是传统的分离、浓集方法。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相的
20、溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性干扰物质是强极性的水溶性物质，因而可用有机溶剂提取法除去大部分内源性干扰物质。样品在提取过程中,虽然待测组分得到了净化，但因微量的组分分布在较大体积的提取溶剂中,常需要使待测组分浓集后再进行测定。方法是挥去提取溶剂，残渣复溶于小体积的溶剂。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥形，这样可使最后数微升溶剂集中在管尖，便于待测组分的复溶与分取.应用液-液萃取法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的 pH 等。1、溶剂的选择 溶剂的选择应根据相似
21、相溶的原则进行，选择溶剂时应注意：对药物分子的未电离形式可溶，而对电离形式不溶；沸点低、易挥发;与水不相混溶；无毒、不易燃烧；具有较高的化学稳定性和惰性；不影响紫外检测。常用液-液萃取的溶剂2、溶剂的用量 一般有机相与水相（体内样品)体积比为 1151.3、水相的pH 当 pH 与 pKa相等时，50的药物以非电离形式存在。对于碱性药物最佳 pH 为高于 pKa 12 个 pH 单位；对于酸性待测药物，则要低于 pKa 12 单位。这样，就可使得 90的药物以非电离形式存在，而更易溶于有机溶剂中。4、提取操作 一般只提取一次.若提取回收率较低（如低于 50%）时，可提取 23 次；若干扰物质为
22、脂溶性，不易除去，则可将提取分离出的含药有机相再用一定 pH 的小体积水溶液反提取后测定，或将反提取液再用有机溶剂提取，如此反复提取可将药物与干扰物质有效分离。液液提取法的优点在于它的选择性和低廉的运行成本,以及可对样品进行净化和浓集的特点.所以本法在体内药物分析中，尤其是采用LCMS 测定时被广泛应用.(三三）固相萃取法及其他方法）固相萃取法及其他方法由于高效液相色谱，尤其是反相高效液相色谱的成功应用，启示人们利用色谱理论，采用装有不同填料的小柱进行体内样品的预处理,而发展了固相萃取（solid-phase extraction，SPE）技术。SPE 技术亦称液-固萃取技术，它的应用大大缩短
23、了样品处理时间，同时可避免乳化现象,而且便于自动化操作.1 1、固相萃取法（、固相萃取法（solidsolidphase extractionphase extraction，SPESPE）（1 1）SPESPE 原理原理将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的体内样品溶液通过小柱时,由于受到“吸附”、“分配”、“离子交换或其他亲和力作用，药物及内源性物质同时被保留在固定相（填料）上,用适当溶剂洗除干扰物质，再用适当溶剂洗脱药物。药物的洗脱方式有两种：一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，因而在用冲洗溶剂洗去干扰物质时药物被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；是干扰物
24、质较药物与固定相之间的亲和力更强，则药物被直接洗脱,干扰物质被保留在萃取柱上,使用较多的是前一种洗脱模式。SPE 的填料种类繁多，可分成亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类，其中亲脂型用得最多。烷基、苯基、氰基键合硅胶都可用作固相萃取吸附剂，其中十八烷基硅烷键合硅胶(ODS 或 C18）最常用.亲脂性键合硅胶容易吸附水中的非极性物质,易用有机溶剂洗脱，适用于萃取、净化水基质体液中疏水性药物。常见的商品 SPE 柱有 Sep-Pak C18、BondElut C18、CN（氰基）、C2（乙基）、Ph（苯基）Baker 10 C18等。（2)SPE
25、2)SPE 操作步骤操作步骤使用亲脂性键合相硅胶 SPE 柱的一般操作步骤如下。活化 用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和待测组分发生分子间相互作用,同时可以除去填料中可能存在的干扰物质。溶剂交换(平衡）用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除过多的甲醇,但冲洗不宜过分。否则会使甲醇含量过低（低于5%）,导致 C18链弯曲折叠,对待测物的吸附能力下降，造成萃取回收率降低。加样 使体内样品通过小柱,并弃去滤过废液.淋洗 用水或适当缓冲液冲洗小柱，去除吸附于固定相上的内源性物质或其他相关干扰物质。洗脱 选择适当的洗脱溶剂洗脱待测物,收集洗脱液，挥干溶剂备用或直接进行在线分析。使用亲脂性键合硅胶 S
26、PE 柱时，需注意：体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速控制在 12ml/min。冲洗液和洗脱剂的强度、用量要适当，否则会导致药物的损失或洗脱选择性下降。通常选用可与水混溶的洗脱剂。萃取碱性药物时,洗脱剂中常需加酸、有机胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂.对于大量样品的处理,则有赖于半自动化和全自动化的仪器。半自动SPE 是指萃取过程机械化，但将洗脱液转移至进样器则需要手工操作。全自动化仪器是通过柱切换技术实现的,利用切换阀使固相萃取小柱直接联入流路中。2 2、超滤法、超滤法超滤法（ultrafiltration）是以多孔性半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。通过选用不同孔径的不对称性微孔
27、膜、按照截留分子量的大小，可分离 30 1000 kD 的可溶性生物大分子物质.与通常的分离方法相比，超滤具有不引入化学试剂，没有相态变化，对待测药物的破坏性小等优点。血液中游离药物的测定可采用分子量截留值在5 万左右的超滤膜，用加压（2 kg/cm2）过滤法或用高速离心法将血浆或血清中游离型药物与分子量大的血浆蛋白以及结合了药物的血浆蛋白分离，从超滤液或离心液中得到游离型药物，然后可直接或经浓缩后测定其浓度。3 3、缀合物水解、缀合物水解药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物(conjugate）.内源性物质有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特别是前两种为最重要
28、的内源性物质。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。尿中药物多数呈缀合状态.由于缀合物较原形药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，需对缀合物进行水解，将缀合物中的药物释出.常用的方法如下：（1)酸水解法 酸水解时,可加入适量的盐酸溶液。酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异。这些条件应通过实验来确定。该法比较简便、快速,但有些药物在水解过程中会发生分解;与酶水解法相比，其专一性较差。（2）酶水解法 对于遇酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法
29、。常用葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase）或硫酸酯酶（sulfatase)。前者可专一地水解药物的葡萄糖醛酸苷缀合物，后者水解药物的硫酸酯缀合物。实际应用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶.一般控制pH 为 4。55.5,37培育数小时进行水解.酶水解比酸水解温和，一般不会引起待测物分解，且酶水解专属性强。其缺点是酶水解时间稍长及酶制剂可能带入的黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。尽管如此，酶水解仍被优先选用。在尿液中采用酶水解,应事先除去尿中能抑制酶活性的阳离子。（3）溶剂解法 缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解，称作溶剂解（solvolysis）。例如尿
30、中的甾体硫酸酯在 pH 1 时加醋酸乙酯提取，产生溶剂解，这时的条件也比较温和.值得注意的是，目前对缀合物的分析逐渐趋向于直接测定缀合物的含量（如采用 HPLC 和 RIA 法)，以获得在体内以缀合物形式存在的量，以及当排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率，从而为了解药物代谢情况提供更多的信息。4 4、化学衍生化、化学衍生化某些药物或代谢物极性大、挥发性低或对检测器不够灵敏,使用常规的HPLC或GC难以有效测定,需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化，如含有 RCOOH、ROH、RNH2、RNHR等官能团的药物都可进行衍生化.第四部分第四部分 体内分
31、析方法的建立与方法验证体内分析方法的建立与方法验证一、体内分析方法建立的一般程序一、体内分析方法建立的一般程序取待测药物或其特定的活性代谢产物、内标等的标准物质，进行条件试验，通过调整色谱条件，使待测药物与内标物质具有良好的色谱参数及峰面积，并有效避开内源性物质的干扰；同时选择适当的检测器，以获得足够的检测灵敏度。二、体内分析方法的验证二、体内分析方法的验证体内分析方法验证的内容包含分析方法的效能指标、样品稳定性及提取回收率.分析方法的效能指标包括特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度。分析方法验证通常采用标准样品与质控样品，其含义如下:1、质控样品（quality contro
32、l sample,QC）在空白生物介质中加入已知量(高、中、低三水平）待测物标准物质制成的样品，用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批样品分析结果的完整性和正确性.2、标准样品(standard sample）在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的系列浓度的样品,用于建立标准曲线，计算质控(QC）样品和未知样品中待测物的浓度。（一)特异性方法的特异性，又称选择性，用以证明该方法所测定的物质是预期的待测物（原形药物或特定的活性代谢物），而体内内源性物质、降解产物及其他共同使用的药物（伍用药物）不干扰样品的测定。1、内源性物质的干扰 分别测定待测药物、活性代谢物的标准物质溶液，及6 个
33、不同个体的空白生物介质和QC 样品，比较图谱或检测信号，确证内源性物质对分析方法无干扰。对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS 或 LC-MS/MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。2、未知代谢产物的干扰 测定 QC 样品和 6 个不同个体用药后的实际体内样品，比较图谱或检测信号，确证其他代谢产物对分析方法无干扰。必要时可通过 HPLCDAD 和 LC-MS(或 LCMS/MS）确证被测定色谱峰的纯度.3、伍用药物的干扰 测定待测药物及伍用药物标准物质溶液、QC样品和添加有伍用药物的干扰样品，比较图谱或检测信号，确证伍用药物对分析方法无干扰.（二)标准曲线与定量范围标准曲线
34、（standard curve），亦称校正曲线（calibration curve）或工作曲线(working curve），反映了体内分析所测定药物的浓度与仪器响应值（如 HPLC 峰面积)的关系，一般用回归方程来评价。最常用的回归分析法为最小二乘法(least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）。标准曲线建立的一般步骤如下：1、系列标准样品的制备取空白生物介质数份,分别加入系列标准溶液适量，制备至少包含6个浓度点的（不包括零点，即空白样品）系列浓度的标准样品（standard samples）。浓度系列一般为等比梯度模式，通常比例常数约为 2，
35、如 1、2、5、10、20、50、100。在此系列中，若体内平均达峰浓度为 50，其1/20 为 2.5，考虑到个体差异,设定最高浓度为 100，最低浓度为 1,可覆盖全部待测体内样品中的药物浓度。内标溶液的浓度一般选择与系列内标溶液的浓度一般选择与系列“标准溶液标准溶液”的几何平均浓度，的几何平均浓度，即标准曲线的中间浓度（如系列标准溶液浓度为 1、2、5、10、20、50 和 100时，中间浓度为 10）相当。2、标准曲线的绘制取系列标准样品，按拟定方法预处理后分析，以待测药物的检测响应（因变量,y）对标准样品中的药物浓度（自变量，x），用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性回归分析,求得回
36、归方程（y=a+bx）及其相关系数(),并绘制标准曲线。标准曲线的定量范围要能覆盖全部待测的体内样品浓度范围，定量上限（upper limit of quantification，ULOQ，标准曲线的最高浓度点)应高于用药后生物介质中药物的峰浓度(Cmax）；定量下限（lower limit of quantification，LLOQ，最低浓度)应低于 Cmax的 105（1/101/20）。标准曲线回归方程的截距应接近于零，若显著偏离零点，应确证其对方法的准确度无影响；斜率应接近或大于1（与坐标的标度选择有关），使具有较高的灵敏度；相关系数应接近于1，即具有良好的相关性，如色谱法 0.99
37、。(三）定量下限三）定量下限定量下限（LLOQ)是标准曲线上的最低浓度点,表示方法的灵敏度，即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。测定方法是取同一生物介质，制备至少 5 个独立的标准样品,其浓度应使信噪比（S/N）大于 5，依法进行精密度与准确度验证。在药代动力学与生物利用度研究中,LLOQ 应能满足 35 个消除半衰期时体内样品中的药物浓度或 Cmax的 1/201/10 的药物浓度的测定.(四）精密度与准确度四）精密度与准确度精密度（precision）是指在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度，通常用QC 样品的相对标准差（RSD)表示。在体内药
38、物分析过程中,无论是药代动力学参数的获得或是治疗药物的监测，通常在1 个分析批(analytical run）内难以完成全部体内样品的分析。而在不同的分析批之间的实验条件（如仪器性能、参数、试剂来源、实验温度、湿度等）有可能发生小的改变，进而对分析结果可能产生影响.所以在体内药物分析中，方法精密度除要评价批内（within-run 或 intrabatch)RSD 外，同时还应评价批间（between-run或 interbatch）RSD。准确度(accuracy）是指在确定的分析条件下测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度,通常用 QC 样品的实测浓度与标示浓度的相对回收率(relativ
39、e recovery，RR）或相对偏差(relative error，RE)表示。1、测定法 使用 QC 样品进行考察，一般选择高、中、低3 个浓度的 QC 样品同时进行方法的精密度和准确度考察。每个QC 样品测定 1次。在测定批内RSD 时,每一浓度至少制备并测定5 个样品.为获得批间RSD，应在不同天（一般为 3 天）连续制备并测定 QC 样品，至少有连续 3 个分析批，不少于 45 个样品的分析结果。2、结果计算与限度要求 QC 样品浓度用回归方程计算。准确度以多次测定结果的平均值与标准值（制备时的加入量)S 比较计算，一般准确度般准确度 RRRR 应在应在 85%11585%115范围
40、内，范围内，在在 LLOQLLOQ 附近应在附近应在 80%80%120%120%范围内。范围内。RRRR 或或 RERE 的计算式如下。精密度一般要求的计算式如下。精密度一般要求 RSDRSD 不超过不超过 1515，在在 LLOQLLOQ 附近附近 RSDRSD 应不超过应不超过 20%.20%.（五）样品稳定性（五）样品稳定性样品稳定性验证内容包括在 1 个分析批内的短期稳定性和在整个样品分析期间的长期稳定性。一般包括：生物样本室温放置(一般 8h 或根据实际情况定)、生物样本于冰箱内（4或20）储存反复冻融3 次、生物样本长期冰冻至整个分析完成期间的稳定性。另外，还应考察处理后待分析样
41、品进样器放置（一般8-9h）、标准物质储备液（4或20放置)的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。测定法方法是取高、低两个浓度的QC 样品，于适当的容器内，在上述规定条件下存放不同时间后测定,每个 QC 样品重复测定 3 次,其平均值的偏差应在零时测定值的5以内。(六）提取回收率六）提取回收率提取回收率（extraction recovery）系指从生物样本中回收得到待测物的收率,通常以%表示。待测物的提取回收率用于评价样品处理方法将体内样品中待测物从生物介质中提取出来的能力。1测定法 制备高、中、低三水平的 QC 样品，每一浓度至少 5 个样品，依据拟定的分析方法操作，每个样品分析测定1
42、 次。另取空白生物介质，照QC样品同法处理后，加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂）,同法制备相同的高、中、低3 个浓度的标准对照样品，同法测定。将测得的 QC 样品的信号强度(如 HPLC 峰面积）与标准对照样品测得的信号强度比较，按下式计算提取回收率:式中，式中，R R 为提取回收率；为提取回收率；A AT T为为 QCQC 样品经制备处理后的信号强度样品经制备处理后的信号强度（如（如HPLCHPLC 峰面积）；峰面积）；A AS S为标准对照样品的信号强度（同为标准对照样品的信号强度（同A AT T)。当采用内标法测定体内样品时，应同时测定内标物质的提取回收率.其测定法同待测药物提取回收率
43、的测定，但仅需制备 1 个浓度（即体内样品分析时加入的浓度）至少 5 个 QC 样品,同法测定、计算。2限度要求 在药代动力学和生物利用度研究中,高、中、低QC 样品的提取回收率应一致、精密和可重现。中、高浓度的中、高浓度的 RSDRSD 应不大于应不大于1515，低浓度的，低浓度的 RSDRSD 应不大于应不大于 20%20%。（七）分析过程的质量控制（七）分析过程的质量控制在未知样品分析过程中应进行分析方法的质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性.在分析过程质控中，推荐由独立的人员随行配制不同浓度的 QC 样品对分析方法进行质量监控。每个QC 水平至少双样本,并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批内未知样品数目较多时，应同时增加各浓度QC 样品数，使 QC 样品数大于未知样品总数的 5。