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1、色谱质谱联用技术及其在色谱质谱联用技术及其在生物样品分析中的应用生物样品分析中的应用仪器组成质量分析器质量分析器：与离子源一样是质谱仪的核心，能将离子源产生的离子按质荷比（m/z）的不同而进行分离，得到按照质荷比大小排列的质谱图。液质联用常用的质量分析器：四极杆质量分析器（quadrupole mass analyzer，Q）三级四极杆质量分析器 （triple stage quadrupole mass analyzer，TSQ）离子阱质量分析器（ion trap mass analyzer，Trap）飞行时间质量分析器（time of flight，TOF）傅里叶变换质量分析器 （Four
2、ier transform mass analyzer，FT）四极杆质量分析器四级杆质量分析器由四根带有特定直流电压（U）和射频电压（V）的平行杆组成。对于给定的直流和射频电压，只有特定质荷比的离子能够通过其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。改变直流和射频电压，可使另一质荷比的离子通过四级场，从而实现质量扫描。1扫描（full scan，SCAN）模式四极杆质量分析器在给定的时间内不间断地对设定的质荷比（m/z）范围内所有离子进行扫描。定性分析：测定未知混合物中各组分的分子量。选择离子监测（SIM）模式选择性地扫描某几个质荷比（m/z）的离子。常用于目标化合物的定量分析和在数量众多的样品中快速筛
3、选目标化合物)。SIM缺点专属性差，可能出现假阳性的结果。故检测离子的选择很重要。SIM中检测离子的选择LC-MS分析中，第一步就是确定响应强且稳定的检测离子酸性化合物一般检测M-H-，碱性化合物检测其M+H+。分子还可通过加合物形成M+NH4+、M+K+、M+Na+等。三级四极杆质谱仪是具有两个质量分析器的二维空间串联质谱仪，液相色谱与其联用成为LC-MS/MS。LC-MS/MS原理：(1)样品通过LC系统后，首先在离子源离子化，并在第一级质谱（MS1）进行质量分析，然后与选定质荷比（m/z）相符合的所有离子离开MS1，进入第二级质谱（碰撞室）；(2)这些进入碰撞室的离子被称为前体离子（母离
4、子），它们在碰撞室中与惰性气体（如Ar，N2 等）进行碰撞诱导裂解，产生一系列产物离子（子离子）；(3)子离子被第三级质谱（MS2）分析，产生质谱图。扫描方式产物离子扫描（product ion scan）：(1)第一级质谱（MS1）只输送某一质荷比的前体离子；(2)前体离子在碰撞室中产生的产物离子进入第三级质谱（MS2），扫描获得前体离子的产物离子质谱图。应用：获得化合物的结构信息，并确定目标化合物最强或最具特征的碎片离子，用于开发目标化合物的定量分析方法。选择反应监测（SRM）(1)第一级质谱（MS1）选择一个或多个前体离子；(2)第三级质谱（MS2）对产物离子进行选择离子监测，只有符合特
5、定质荷比（m/z）的离子才能被检测到。SRM应用：目标化合物的定量分析。优点：SRM经历了两次选择，与单极四极杆质谱的SIM方式相比，SRM有更高的专属性和抗干扰能力，信噪比更大，具有更低的检测限。2SRM有利于测定复杂样品中痕量组分。LC-MS生物分析的注意事项基质效应（matrix effect，ME）：LC-MS分析时，内源性物质使待测物的离子化效率降低或增强，从而引起响应降低或增高，影响测定结果的准确性，已经引起人们高度关注。基质效应成分来源：主要是磷脂、胆固醇等内源性物质。基质效应消除方法1.优化改进样品提取制备方法基质效应与生物样品处理不干净密切相关，应选择合适样品前处理方法。可比
6、较液-液萃取、固相萃取、蛋白沉淀 从中选择基质效应最小的样品制备方法。2.优化色谱条件：基质效应是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱引起的。优化色谱条件，将内源性物质与待测物在色谱柱上有效的分离，可以去除或降低基质效应。3.选择合适的质谱条件ESI源中，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面，基质效应比较明显。在实际应用中，可以考虑改用APCI方式。4.选择合适内标 内标在LC-MS生物分析中有广泛的应用，能提高定量分析的准确度、精密度及方法的耐用性。同位素标记的内标物是降低或消除基质效应最有效的方法，应尽量使用。质谱响应的线性范围质谱响应会出现饱和现象样品浓度过高时，供试品分子之间竞争微滴表面
7、位置，样品离子信号达到上限，从而导致标准曲线的高浓度点响应偏小，脱离线性。方法的应用HPLC-MS法测定血浆中多奈哌齐的含量盐酸多奈哌齐(donepezil hydrochloride)为可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，临床用于阿尔茨海默氏症的治疗。临床床每次常用剂量为5mg。思路：3结构：含叔氮，亲质子性强，可结合一个质子生M+H+进行正离子检测。质谱条件的选择：Scan结果：多奈哌齐 乙哌立松原则：选择特异性强，丰度大且稳定的离子的做为目标离子。4其他质谱条件的选择 质谱条件：质谱条件：离子检测方式：选择性离子检测（SIM）；离子极性：正离子（Positive）；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化（ESI）；检测对象：多奈哌齐(M+H+，m/z 380.2）；内标：乙哌立松（M+H+，m/z 260.2）；传输区电压：30 V；干燥气流速：10 Lmin-1；雾化室压力：40 psig；干燥气温度：350。色谱条件：色谱条件：色谱柱：Hedera ODS-2（dp 5?m,150 mm4.6 mm）；柱 温：25；流动相：甲醇-10 mmol/L 醋酸铵水溶液（含0.05%的甲酸）（65:35 v/v）；流 速：1 ml/min。结果：该法简便、快速、灵敏，线性良好。最低定量限为0.1 ng/ml。5