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1、基因定位（基因定位（gene mappinggene mapping）：是指将基因定位于某一：是指将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序与距离。序与距离。基因在染色体上各有其一定的位置基因在染色体上各有其一定的位置 确定基因的位置确定基因的位置主要是确定基因之间的距离和顺序主要是确定基因之间的距离和顺序 基因之间的距离是用基因之间的距离是用交换值来表示的，叫交换值来表示的，叫图距图距，图距单位是，图距单位是厘摩（厘摩（centimorgan，cM)cM)。准确地估算出交换值准确地估算出交换值 确定基因在染色体上的相
2、对确定基因在染色体上的相对位置位置 把基因标志在染色体上。把基因标志在染色体上。基因定位所采用的主要方基因定位所采用的主要方法是是两点测验两点测验和和三点测验三点测验。4.14.1真核生物基因定位的基本方真核生物基因定位的基本方和遗传图的制作和遗传图的制作第2页/共97页第1页/共97页1 1两点测验两点测验:先用先用三次杂交三次杂交、再用、再用三次测交三次测交(隐性纯合亲本隐性纯合亲本)来分别来分别测定测定两对基因间两对基因间是否连锁是否连锁，然后再根据其，然后再根据其交换值确定交换值确定它们它们在同一染色体上的在同一染色体上的位置位置。测出Aa-Bb间重组率 确定AB是否连锁；测出Bb-C
3、c间重组率 确定BC是否连锁；测出Aa-Cc间重组率 确定AC是否连锁。第3页/共97页第2页/共97页 如果上述如果上述3 3次测验确认次测验确认3 3对基因间都是连锁对基因间都是连锁 根据交根据交换值的大小换值的大小 确定这三对基因在染色体上的位置。确定这三对基因在染色体上的位置。第4页/共97页第3页/共97页例如例如:已知玉米子粒已知玉米子粒有色有色(C)(C)对对无色无色(c)(c)为显性，为显性，饱满饱满(Sh)(Sh)对对凹陷凹陷(sh)(sh)为显性，为显性，非糯性非糯性(Wx)(Wx)对对糯性糯性(wx)(wx)为显性。为显性。第一组试验：第一组试验：CCShSh CCShS
4、h ccshshccshsh F1F1 CcShsh CcShsh ccshshccshsh为了明确这三对基因是否连锁遗传，分别进行了以下三个试验为了明确这三对基因是否连锁遗传，分别进行了以下三个试验:第二组试验：第二组试验：wxwxShSh wxwxShSh WxWxshsh WxWxshsh F1F1 WxwxShshWxwxShsh wxwxshshwxwxshsh第三组试验：第三组试验：WxWxCC WxWxCC wxwxccwxwxcc F1F1 WxwxCcWxwxCcwxwxccwxwxcc第5页/共97页第4页/共97页第一组试验：第一组试验：CCShSh CCShSh ccs
5、hshccshsh F1F1 CcShsh CcShsh ccshshccshsh4032 4035 149 152交换值交换值(149(149152)/(4032+4035+149+152)100%152)/(4032+4035+149+152)100%3.6%3.6%第6页/共97页第5页/共97页第二组试验第二组试验：wxwxShSh wxwxShSh WxWxshshWxWxshsh F1F1 WxwxShshWxwxShshwxwxshshwxwxshsh交换值交换值(1531(15311488)/(15311488)/(153159915991588558851488)100%14
6、88)100%20%20%第7页/共97页第6页/共97页第三组试验：WxWxCC wxwxcc F1 WxwxCcwxwxcc交换值(739717)/(25427397172716)100%22%第8页/共97页第7页/共97页第一、二个试验第一、二个试验结果表明，结果表明，CcCc和和ShshShsh是连锁遗传的，是连锁遗传的，WxwxWxwx和和ShshShsh是连锁遗传的。所以是连锁遗传的。所以CcCc和和WxwxWxwx肯定是连锁遗传的，肯定是连锁遗传的，根据这二个试验结果，这三对基因在同一染色体上的排列顺根据这二个试验结果，这三对基因在同一染色体上的排列顺序有两种可能：序有两种可能
7、：第9页/共97页第8页/共97页第三个试验第三个试验结果表明，结果表明，WxwxWxwx和和CcCc两对基因在染色体上两对基因在染色体上相距相距2222个遗传单位。个遗传单位。这与这与23.623.6个遗传单位接近。个遗传单位接近。所以，可所以，可以确定以确定第一种排列顺序符合实际。第一种排列顺序符合实际。这样就把这三对基因的相对位置初步确定下来。这样就把这三对基因的相对位置初步确定下来。用同样用同样的方法和步骤，的方法和步骤，还可以把还可以把第四对、第五对第四对、第五对及其它各对基因的及其它各对基因的连锁关系和位置确定下来。连锁关系和位置确定下来。不过，如果两对连锁基因之间的距离不过，如果
8、两对连锁基因之间的距离超过超过5 5个遗传单位，个遗传单位，两点测验法准确性就不高。两点测验法准确性就不高。第10页/共97页第9页/共97页摩尔根和他的学生Sturtevant改进了上述二点测交，创造了新的测交法三点测交。在两点测交中，对于双交换是无法检出的，在两点测交中，对于双交换是无法检出的，因为在两个基因之间双交换的结果等于没交因为在两个基因之间双交换的结果等于没交换。换。第11页/共97页第10页/共97页2.2.三点测交（三点测交（three-point testcross)three-point testcross)三点测验三点测验:通过一次杂交和一次用隐性亲本测交，同时测定三对
9、通过一次杂交和一次用隐性亲本测交，同时测定三对基因在染色体上的位置，是基因定位最常用的方法。基因在染色体上的位置，是基因定位最常用的方法。优点：优点：(1)(1)纠正两点测验的缺点，使估算的交换值更为准确；纠正两点测验的缺点，使估算的交换值更为准确；(2)(2)通过一次试验可同时确定三对连锁基因的位置。通过一次试验可同时确定三对连锁基因的位置。第12页/共97页第11页/共97页(1 1)确确定定基基因因在在染染色色体体上上的的位位置置：以玉米C Cc c、S Sh hs sh h和W Wx xw wx x三对基因为例：P P 饱满、非糯、有色凹陷、糯性、无色 +s sh hs sh h w
10、wx xw wx x c cc c F F1 1 饱满、非糯、有色 凹陷、粒性、无色 +s sh h +w wx x +c c s sh hs sh h w wx xw wx x c cc cF Ft tF F1 1配配子子及及F Ft t表表型型见见下下表表：第13页/共97页第12页/共97页第14页/共97页第13页/共97页 CCShSh CCShSh ccshshccshsh F1F1 CcShsh CcShsh ccshshccshsh FtFtnC-Sh=(98+107+39+19)/6033=4.36%先不考虑先不考虑wxwx，只考虑，只考虑C-ShC-Sh间的情况，这样就可以
11、计算间的情况，这样就可以计算出出C-ShC-Sh间的重组值间的重组值 第15页/共97页第14页/共97页不考虑不考虑wxwx，只考虑，只考虑Wx-ShWx-Sh间的情况间的情况,可算出可算出Wx-ShWx-Sh间间的交换值的交换值 wxwxShSh wxwxShSh WxWxshsh WxWxshsh F1F1 WxwxShsh WxwxShsh wxwxshshwxwxshsh Ft Wx-Sh=(672+662+39+19)/6033=23.07%Wx-Sh=(672+662+39+19)/6033=23.07%第16页/共97页第15页/共97页 WxWxCC WxWxCC wxwxc
12、cwxwxcc F1F1 WxwxCcWxwxCcwxwxccwxwxcc Ft C-Wx=(98+107+672+662)/6033=25.51%按照同样的方法可算出按照同样的方法可算出Wx-ShWx-Sh间的交换值间的交换值 第17页/共97页第16页/共97页根据这三个数据可以将这三个基因作如下的排根据这三个数据可以将这三个基因作如下的排列列 第18页/共97页第17页/共97页第19页/共97页第18页/共97页 三点测交的一般方法 表型实得数 比例(%)重组发生位点 a-b a-c c-b a +580 80.9 +b c 592 a b c 45 5.9 +40 a b +89 1
13、2.6 +c 94 a +c 3 0.6 +b +5 合计 1448 100 18.5 6.5 13.2 第20页/共97页第19页/共97页 ab=18.5 a c b c6.513.2 19.7 cM ab(a c b c)?应加双交换值 abaccb2（ac）（cb）18.5 0.626.5 13.2 19.7(cM)a c b 13.2cM 6.5 cM 图 acb的顺序和图距 第21页/共97页第20页/共97页 a +c b a c b +a +b +c +a c +c第22页/共97页第21页/共97页三点测交实验的意义在于三点测交实验的意义在于:（1）比两点测交方便、准确。一次
14、三点测交相当于3次两 点测交实验所获得的结果；（2）能获得双交换的资料；（3）证实了基因在染色体上是 直线排列的。第23页/共97页第22页/共97页3 3干涉干涉(interferenceinterference)在染色体上，每发生一次单交换时，它的邻近基因间也发在染色体上，每发生一次单交换时，它的邻近基因间也发生一次交换的机会就会减少，这种现象称为干涉。生一次交换的机会就会减少，这种现象称为干涉。根据概率理论，如单交换的发生是独立的，则根据概率理论，如单交换的发生是独立的，则双交换值双交换值 =单交换值单交换值单交换值单交换值 =0.23070.436100%=1.0%=0.23070.4
15、36100%=1.0%实际双交换值只有实际双交换值只有0.15%0.15%，说明存在，说明存在干涉。干涉。第24页/共97页第23页/共97页并发系数并发系数 =实际双交换值实际双交换值/理论双交换值理论双交换值 =0.15/1.0=0.15 0=0.15/1.0=0.15 0，干扰严重。，干扰严重。并发系数常变动于并发系数常变动于0 10 1 之间。之间。并发系数等于并发系数等于1 1时，无干扰，两个单交换独立发生；时，无干扰，两个单交换独立发生；并发系数等于并发系数等于0 0时，表示完全干扰，时，表示完全干扰，即一点发生交换后其邻近一点就不交换。即一点发生交换后其邻近一点就不交换。表示干扰
16、程度通常用并发系数表示：第25页/共97页第24页/共97页4.4.连锁遗传图制作连锁遗传图制作 通过连续多次二点或三点测验，可以确定位于同一染色体基通过连续多次二点或三点测验，可以确定位于同一染色体基因的位置和距离，把它们标志出来后可以绘成因的位置和距离，把它们标志出来后可以绘成连锁遗传图。连锁遗传图。连锁群连锁群：存在于同一染色体上的全部基因。：存在于同一染色体上的全部基因。一种生物连锁群数目与染色体对数一致，可暂时少于染色一种生物连锁群数目与染色体对数一致，可暂时少于染色体对数：体对数：如：如：水稻水稻n=12n=12、玉米、玉米n=10n=10、大麦、大麦n=7n=7连锁群数连锁群数
17、12 10 712 10 7 绘制连锁遗传图绘制连锁遗传图：以最先端基因为以最先端基因为0 0，依次向下，不断补，依次向下，不断补充变动。位于最先端基因之外的新发现基因，则应把充变动。位于最先端基因之外的新发现基因，则应把0 0点让给点让给新基因，其余基因作相应变动。新基因，其余基因作相应变动。第26页/共97页第25页/共97页第27页/共97页第26页/共97页图10-4果蝇的遗传学图(遗传连锁图)第28页/共97页第27页/共97页关于遗传图还需做以下说明：重组率在0%-50%之间，但在遗传图上，可以出现50个单位以上的图距。原因是这两个基因间发生多次交换的缘故。所以从图上数值知重组率只
18、限临近的基因座之间。第29页/共97页第28页/共97页第30页/共97页第29页/共97页4.2脉胞霉四分子及其遗传学分析第31页/共97页第30页/共97页链孢霉（链孢霉（Neurospora crassa）的生）的生活史：活史：链孢霉Neurospora是真菌，属于子囊菌纲，在遗传研究上应用极广。这类真菌特别有利之处在于它们一方面行有性生殖，具有跟高等动植物行为相象的染色体，另一方面又象细菌那样有较短的生活周期。链孢霉的有性生殖周期只要10天，能在含碳源和某些无机盐的简单培养基中生长。第32页/共97页第31页/共97页链孢霉(Neurospora crassa)是一种丝状真茵，生活史相
19、当复杂(图6.2)。培养的链孢霉是由许多分枝的细丝即菌丝组成的，菌丝由隔壁分成隔，每隔有近百个单倍体核。它们的生殖方式通常是无性的，菌丝体发出气生菌丝，长出无性孢子，叫做分生孢子，有的是单核的小分生孢子，有的是多核的大分生孢子，分生孢子萌发出新的菌丝。第33页/共97页第32页/共97页第34页/共97页第33页/共97页有性生殖只有在两个不同交配型菌株一起生长时才会进行。在固体琼脂上，两个菌株都形成许多雌性生殖结构，称为原子囊壳。原子囊壳是菌丝的圆形聚合物，包有特殊的菌丝，向空间伸展成为受精丝。不同交配型的小分生孢子(有时甚至一根菌丝体)与受精丝相接触时就发生受精作用。准备进行融合受精细胞的
20、核移至受精丝下部，进入称为产囊体的特殊菌丝中去。这时细胞核的变化是很复杂的，实际上两种交配型的细胞核都进行分裂，成对的不同交配型的细胞核分到许多产囊菌丝中去。第35页/共97页第34页/共97页接着在每条产囊菌丝中都发生下列过程：由每种交配型的一个核共同形成子囊原始细胞，这两个核在伸长的细胞中融合成二倍体细胞核；二倍体细胞核立即进行减数分裂；减数分裂的四个产物再进行有丝分裂，在一个子囊中形成四对子囊孢子。同时，其他菌丝形成了一个厚壁包围着产囊菌丝，构成长颈瓶状的子囊壳。第36页/共97页第35页/共97页特别应当注意的是：每个子囊是一次减数分裂的产物，而每对孢子则是有丝分裂的产物，因此每对孢子
21、的每个成员具有相同的基因型。每次减数分裂所产生的四个产物即四分体(四个分生孢子)不仅仍保留在一个子囊中，而且在子囊中成线状排列。这是一种有顺序的四分体(四分子或八分子在子囊中呈直线排列直列四分子，直列八分子，具有严格的顺序)，是提供遗传分析独一无二的非常重要的结构。第37页/共97页第36页/共97页4.2.1四分子分析（四分子分析（tetrad analysis）和着丝粒作图）和着丝粒作图指根据一个子囊中四个按严格顺序直线排列的四分子(或其有丝分裂产物子囊孢子)表现进行的遗传分析，也称为直列四分子分析。链孢霉的特点是它的四分体是顺序排列的。不仅减数分裂的四个产物在子囊中仍连在一起，而且代表减
22、数分裂四个染色单体的子囊孢子是直线排列的，排列的顺序跟减数分裂中期板上染色单体的定向相同。第38页/共97页第37页/共97页四分体遗传分析的特殊意义在于：(1)能从四分体不同类型出现的相对频率计算连锁关系；(2)能计算标记基因与着丝点之间的连锁；(3)子囊中子囊孢子严格的交互性表明减数分裂是一个交互过程；(4)分析表明，每次交换仅涉及四个染色单体中的两个，而多次交换则可能涉及二价体的两个、三个以至所有四个染色单体。第39页/共97页第38页/共97页第40页/共97页第39页/共97页第41页/共97页第40页/共97页第42页/共97页第41页/共97页让我们考察一下交配型不同的菌株的杂交
23、结果。二倍体子囊原始细胞是Aa，经减数分裂产生两个A和两个a，再经有丝分裂产生四对子囊孢子。这四对子囊孢子在子囊中有六种排列顺序(表6.3)。为了方便起见，我们写出子囊孢子对的基因型而不写单个孢子的基因型。第43页/共97页第42页/共97页表6.3 链孢霉的第一次和第二次分裂分离Lindegren(1932)关于交配型等位基因A和a分离的数据。他解剖了274个子囊并测定了每一孢子对的交配型。表中是六种可能子囊类型的数值。123456AAaaAAaaAaAaaAaAAaaAaAAa观察到的子囊数105129951016第44页/共97页第43页/共97页表6.3中第1和第2种类型的子囊是第一次
24、分裂分离的子囊，因为在第一次减数分裂时带有A基因的两条染色单体移向一极，而带有a基因的另外两条染色单体移向另一极，因此在每一子囊中两个A孢子对相互邻接，两个a孢子对也相互邻接。第3至第6种类型的子囊是第二次分裂分离的子囊，因为要到第二次减数分裂A和a才分离，子囊中相同的孢子对不相邻接。第45页/共97页第44页/共97页 A A A A A M A M A A a a A a a a a a a a (a)第一次分裂分离 第46页/共97页第45页/共97页 A A A A A M a M a a A A a a A a a A a a (b)第二次分裂分离 第47页/共97页第46页/共97
25、页 第一次分裂分离:第二次分裂分离:图513 8个子囊孢子排列类型第48页/共97页第47页/共97页*着丝粒作图(centromere mapping)如果减数分裂过程中，基因位点与着丝点间不发生非姊妹染色单体间交换，一对等位基因分离产生的两种类型的孢子将分别排列在子囊的两端；如果发生交换将产生不同的排列方式。可根据子囊中孢子排列方式判断该次减数分裂是否发生交换，并计算交换值；该交换值为基因与着丝点间的交换值，因此可估计基因位点与着丝点间遗传距离，并进行连锁作图，称着丝点作图。如果减数分裂的产物是随机分布的话，六种类型子囊的分布频率应该相同，而Lindegren得到的数据(表6.3)却清楚地
26、表明并非如此。这是为什么呢？第49页/共97页第48页/共97页在减数分裂时，带有A和a的同源染色体沿其长度配对，再分裂为染色单体并参与重组；如果二价体在中期板上定向和正常分离的话，在两个同源染色体之间至少应有一个交叉，倘若A位点与着丝点之间没有产生交换，两个等位基因A和两个等位基因a仍将附着在同一个着丝点上，并在第一次减数分裂的后期一起分离，减数分裂就只能产生第l或第2种类型的子囊。换句话说，第一次分裂分离时基因位点与着丝点之间并未发生交换。第50页/共97页第49页/共97页当A位点与着丝点之间发生交换时，第一次减数分裂后，每个子细胞核得到一条具A和a染色单体的染色体。只有在第二次减数分裂
27、中，每个染色单体分到各子囊孢子去的时候，A和a才相互分离。结果在子囊中，A或a孢子对，或a和A孢子对互相分开；每一个第二次分裂分离的 子囊是供试位点与着丝点之间发生一次交换的结果。第51页/共97页第50页/共97页根据这种特殊情况，就有可能计算某一位点和着丝点之间的重组百分率。重组百分率的标准公式如下：第52页/共97页第51页/共97页在第一次分裂分离的子囊中，Aa位点与着丝点之间没有重组的染色单体。在第二次分裂分离的子囊中，四条染色单体中有两条(即1/2)发生重组。在所有子囊中重组染色单体数是第二次分裂分离子囊数的2倍(2N2)。染色单体的总数是子囊数的4倍(4N1+4N2)，这里N1和
28、N2是第一次和第二次分裂分离的子囊数。第53页/共97页第52页/共97页因此，重组百分率是：这等于第二次分裂分离子囊数百分率的一半第54页/共97页第53页/共97页根据Lindegren的数据，我们可以计算A位点和着丝点之间的重组百分率是：第55页/共97页第54页/共97页4.2.2二对基因的四分子分析现在我们考察一下涉及两对等位基因分离的杂交。第56页/共97页第55页/共97页连锁分析杂交：nic+ade其中 nic是菸酸依赖型，要在培养基中添加菸酸才能生长，ade是腺嘌呤依赖型，要在培养基中添加腺嘌呤才能生长。上面已讲过，一对基因杂交，有6种不同的子囊型，两对基因杂交，有6636种
29、不同的子囊型；但是可把36种不同的子囊型归纳为7种基本子囊型。这7种子囊型和实得的子囊数列于表6.5第57页/共97页第56页/共97页表4-3 nic+ade 杂交结果子囊型（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）基因型次序+ade+adenic+nic+nic adenic ade+ade nic +nic ade+adenic ade+nic+adenic +adenNic +nic ade+nic ade+nic ade+adenic +分离发生的时期M1M1M1M1M1M2M2M1M2M2M2M2M2M2子囊型分类PDNPDTTPDNPDT实得子囊数80819059015第58页/
30、共97页第57页/共97页分析方法相同，先算出nic位点和着丝点的重组百分率为：ade和着丝点的重组百分率为：第59页/共97页第58页/共97页nic和ade之间有三种可能性可以考虑：第一，nic和ade可能位于不同的染色体上，并且是自由组合的。但第一种类型的子囊数大大超过预期，排除了这种可能性。第二，nic和ade可能在同一条染色体上，并位于着丝点的两边。这时它们之间的重组百分率大约应是14%。但是，nic和ade在同一条染色体上，并位于着丝点的同一侧。第60页/共97页第59页/共97页第三，它们在同一条染色体臂上，重组百分率只有4.25%。如果nic和ade连锁，其重组百分率用重组孢子
31、数总孢子数100的公式来计算。表6.5中，有208个重组孢子对，重组百分率为：第61页/共97页第60页/共97页因此连锁顺序应该是：注意：9.30-5.05=4.25 5.2。这种差异我们在三点测验时也曾看到，这是因为某些二价体中存在一次以上重组的缘故（双交换）。染色单体干扰第62页/共97页第61页/共97页第63页/共97页第62页/共97页第64页/共97页第63页/共97页第65页/共97页第64页/共97页第66页/共97页第65页/共97页第67页/共97页第66页/共97页六种子囊孢子排列方式第68页/共97页第67页/共97页第一次分裂分离与第二次分裂分离(1-2)两种排列方
32、式：野生型lys+和突变型lys-在 AI 彼此分离，称第一次分裂分离(first division segregation)。着丝粒和lys基因位点间不发生非姊妹染色单体交换，因此这两种子囊类型就是非交换型子囊。(3-6)四种排列方式：第一分裂产物中野生型与突变型未发生分离，野生型和突变型 AII 发生分离，称第二次分裂分离(second division segregation)。着丝粒与基因位点间发生非姊妹染色单体交换，因此这四种子囊均为交换型子囊。第69页/共97页第68页/共97页非交换型、交换型子囊的形成第70页/共97页第69页/共97页将着丝点当作一个基因位点，计算基因位点与着
33、丝点间的交换值，估计基因与着丝点间的遗传距离，叫着丝点距离。第71页/共97页第70页/共97页4.3体细胞交换与基因定位第72页/共97页第71页/共97页 在正常情况下分裂分离和重组都是在减数分裂中发生的，但实验证据表明在有的有机体中交换也可发生在有丝分裂中，这叫做体细胞交换(somatic crossing over)或有丝分裂交换(mitotic crossing over)。第73页/共97页第72页/共97页第74页/共97页第73页/共97页第75页/共97页第74页/共97页 当a是纯合子的时候，b也是纯合子，但在有些克隆中，当b是纯合子的时候，a却不是，这说明a比b更靠近着丝
34、粒。分析所有的克隆表型就会发现a是最近的，b次之，再着是c、d，最远的是e。某个体细胞克隆所出现的频率反映了某个有丝分裂交换所发生的频率，这个频率就可以用来计算有丝分裂图距。根据上面的例子，在a和b之间发生交换产生bcde的纯合子表型，因此a和b之间的重组值为6030020%，即ab之间的图距为20。现假设观察到对a、b、c、d、e中任何一个基因是纯合子的个体300个，分布如下：第76页/共97页第75页/共97页 进行有丝分裂重组分析时需要构建杂合子。从构巢曲霉的两个不同品系开始构成异核体，然后再筛选出二倍体核。这两个品系在基本培养基上都不能生长，但异核体由于基因的互补是可以生长的。w和y两
35、对等位基因都是控制无性孢子的颜色的，w导致产生白色孢子，y导致产生黄色孢子。品系1：wad+propaby+bio品系2：w+adpro+pab+ybio+第77页/共97页第76页/共97页用于曲霉实验中单倍体和二倍体的基因型与孢子颜色的关系 第78页/共97页第77页/共97页第79页/共97页第78页/共97页人类基因定位研究近来发展很快，在研究技术上主要应用体细胞杂交和DNA分析法。但是，对于那些无法以体外培养杂种细胞表达的性状或疾病，就需要借助于家系连锁分析法。这种方法适合于分析基因连锁、基因定位、基因诊断等。4.4人类基因定位的基本方法第80页/共97页第79页/共97页4.4.1
36、 家系分析法家系的连锁分析首先要从群体中选择适合的家系，要求被挑选家系中双亲之一或两个为双杂合体，并且注意双杂合体家系要随机抽样，避免产生偏倚。第81页/共97页第80页/共97页同时必须剔除下列几种家系：（1）双亲性状不能在子代中得到分离的，如GgTtGGTT；（2）家庭中仅有一个子代的；（3）亲本之一的基因型不明或死亡的。第82页/共97页第81页/共97页三代的系谱在三代系谱中较容易确定子代是否发生基因重组，可直接计算重组值。例：如图，设黑色表示患一种显性的肌强直功能不全(mytonic dystrophy)；性状标志为唾液分泌类型，由Se和se一对等位基因所控制，Se为显性基因。第83
37、页/共97页第82页/共97页肌强直功能不全和唾液分泌类型发生分离的家庭第84页/共97页第83页/共97页I-1个体患有肌强直功能不全症并伴有唾液分泌型的特性；I-2不患此病并为非分泌型。其生育的女儿（II-1）也为肌强直功能不全症并伴有唾液分泌型，所以她（II-1）的疾病和分泌型性状的两个基因来自父亲，说明疾病基因和Se基因在一条染色体上，她的基因型为GSe/gse，为相引相的双杂合体。第三代的性状开始分离，有的为分泌型伴疾病，有的不伴病。第85页/共97页第84页/共97页在第三代六个子代中，III-1个体为健康者并为分泌型，说明原来疾病基因和Se基因连锁的染色体与其同源染色体间发生了交
38、换，因此该个体为重组体。III-2 III-6均为非重组体。因此重组率为：1/6。第86页/共97页第85页/共97页4.4.2 体细胞杂交法体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。细胞杂交又称细胞融合（cell fusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybrid cell)，含有双亲不同的染色体。第87页/共97页第86页/共97页杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条
39、人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。第88页/共97页第87页/共97页由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上（表6.6）。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。第89页/共97页第88页/共97页第90页/共97页第89页/共97页 表6.6 杂种细胞系的染色体和T
40、K活性 细胞系 人类染色体 TK活性 （1）5，9，12，21 （2）3，4，17，21 （3）5，6，14，17，22 （4）3，4，9，18，22 （5）1，2，6，7，20 （6）1，9，17，18，20 第91页/共97页第90页/共97页表表4-54-5杂种细胞中标记基因的存在与人体染色杂种细胞中标记基因的存在与人体染色体间的关系体间的关系 杂种细胞系项目ABCDE人体基因1234人体染色体123第92页/共97页第91页/共97页4.4.3核酸杂交技术4.4.3.1克隆基因定位法 用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA顺序进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色
41、体的位置。以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法定位结果 第93页/共97页第92页/共97页4.4.3.2原位杂交法(in situ hybridization)是一种分子水平和染色体水平相结合、以标记了同位素、生物素或荧光染料的待定位基因的DNA序列或该基因转录产生的RNA分子为探针，直接同变性后的中期染色体进行原位杂交，探针同染色体DNA中与其互补的序列结合成双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针在染色体上的位置，达到基因定位的目的。第94页/共97页第93页/共97页第95页/共97页第94页/共97页4.4.3.3原位PCR(in situ PCR)原位PCR是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原位PCR扩增，再进行DNA分子原位杂交以进行细胞内基因(或特定DNA片段)的定位或检出的技术。第96页/共97页第95页/共97页、固定细胞，尽量保存细胞固有的形态与结构。、蛋白酶消化：用胃蛋白酶、蛋白酶K等消化固定后的蛋白质交联网络屏障，使PCR反应试剂与靶DNA充分接触。、原位PCR扩增。、产物检测：直接法可用放射自显影、免疫组织化学或荧光检测等，间接法需用特异性标记探针进行引物杂交。原位PCR的基本步骤是：第97页/共97页第96页/共97页感谢您的观看！第97页/共97页