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1、前 言大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等阶段。并且，各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因阶段。并且，各阶段都可能发生多
2、种癌基因激活、抑癌基因失活。表现为失活。表现为增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻。第1页/共94页 长期以来，长期以来，长期以来，长期以来，“细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞”的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导
3、下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。19711971年，年，年，年，FriendFriend报告报告报告报告小鼠红白血病细胞（小鼠红白血病细胞（小鼠红白血病细胞（小鼠红白血病细胞（MELMEL）可被二甲基亚砜（）可被二甲基亚砜（）可被二甲基亚砜（）可被二甲基亚砜（DMSODMSO）诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱诱导分化，开
4、创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。细胞分化与肿瘤细胞分化与肿瘤第2页/共94页一、肿瘤细胞诱导分化的有关概一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念念1.分化分化(differentiation）细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。如人起源于一个受精卵，通过细胞分裂形成内、中、外三个胚层细胞。第3页/共94页2.反分化反分化(retro-differentiati
5、on)又称去分化又称去分化(dedifferentiation)，肿瘤的反分化，肿瘤的反分化是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象表型的现象。恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟。恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟。第4页/共94页3.3.再分化再分化（redifferentiation）又又称称逆逆转转（reversion），它它是是指指在在分分化化诱诱导导剂剂的的作作用用下下，恶恶性性肿肿瘤瘤细细胞胞被被诱诱导导而而重重新新向向正正常常细细胞胞的的方方向向演演变变分分化化，表表现现为为形形态态学学、生生物物学学、生生物物化化学学等等诸诸
6、多多指指标标均均向向正正常常细细胞胞接接近近，甚至完全转变为正常细胞。甚至完全转变为正常细胞。第5页/共94页二、分化诱导剂二、分化诱导剂1.1.内源性分化诱导剂内源性分化诱导剂 内内源源性性分分化化诱诱导导剂剂是是由由肿肿瘤瘤或或宿宿主主细细胞胞产产生生的的具具有有分分化化诱导作用的化学物质。它有以下几种：诱导作用的化学物质。它有以下几种：集落刺激因子（集落刺激因子（CSF）：分为）：分为CSF-M和和CSF-G；粒细胞巨噬细胞分化因子（粒细胞巨噬细胞分化因子（GMDF）；）；类类固固醇醇类类化化合合物物：如如糖糖皮皮质质激激素素和和1，25-（OH）2-vitD3；细胞因子细胞因子:如如T
7、NF-和和INF-；糖脂糖脂:如神经节苷脂如神经节苷脂GM3；其它，如其它，如cAMP等。等。第6页/共94页2.2.外源性分化诱导剂外源性分化诱导剂 可分为以下几类：可分为以下几类：无机化合物：亚硒酸钠等。无机化合物：亚硒酸钠等。简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜(DMSO)、六次、六次甲基二乙酰胺甲基二乙酰胺(HMBA)等。等。维生素维生素A类化合物：维甲酸、类化合物：维甲酸、AM80、芳维甲等。、芳维甲等。佛波酯类化合物：佛波酯类化合物：12-O-十四酯酰佛波十四酯酰佛波-13-乙酸乙酸(TPA)。抗生素类：放线菌素抗生素类：放线菌素D、丝裂霉素等；
8、、丝裂霉素等；抗癌药：抗癌药：6-巯基嘌呤、巯基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。氮胞嘧啶等。第7页/共94页三三、诱导肿瘤分化的研究、诱导肿瘤分化的研究 1.1.体外分化诱导模型体外分化诱导模型(1)(1)白血病细胞分化诱导模型白血病细胞分化诱导模型 最最常常用用的的是是急急性性髓性白白血血病病细细胞胞株株HL-60。它它在在分分化化诱诱导导剂剂作作用用下下可可出出现现分分化化表表型型如如形形态态上上由由早早幼幼粒粒白白血血病病细细胞胞分分化化为为中中、晚晚幼幼粒粒、杆杆状状核核细细胞胞和和分分叶叶核核细细胞胞，生生化化方方面面出出现现硝硝基基蓝蓝四四氮氮唑唑还还原原性性（NBT），功功能能方方面面出出
9、现现吞吞噬噬活活性性及及趋趋化化性性，生生物物学学方方面面丧丧失失了了在在软软琼琼脂脂培培养养基基上上形形成成集集落落及及裸裸鼠鼠体体内内移移植植成成活的能力。活的能力。第8页/共94页(2)(2)实体瘤分化诱导模型实体瘤分化诱导模型 人人胃胃癌癌分分化化诱诱导导模模型型国内外有人用DMSO、HMBA、suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时，癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学等方面均出现分化特征。人人神神经经母母细细胞胞瘤瘤分分化化诱诱导导实实验验 在正丁酸、苯丁酸及其盐类作用后，瘤细胞可形成树突状结构，功能上能产生神经递质合成酶，生物学上其致瘤性明显降低，表
10、现出分化的特点。第9页/共94页 人人粘粘液液表表皮皮样样癌癌分分化化诱诱导导实实验验 MEC-1细胞是上皮样细胞，体外增殖迅速，形态异型性明显，裸鼠体内成瘤性，在HMBA的作用下出现分化表型：生长抑制、核异型性降低、表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒、DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。其其它它实实体体瘤瘤分分化化诱诱导导模模型型其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。第10页/共94页 2.2.体内分化诱导模型体内分化诱导模型 目前，体内分化诱导尚无理想的模型。人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法;人实体瘤采用小鼠肾包膜下
11、移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。分化诱导效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长，细胞标记酶、抗原以及形态的变化来判断。国内用NB4细胞株建立了SCID小鼠人APL腹水细胞模型，在ATRA作用下能发生分化，如明显提高NBT还原率和CD11b的表达，小鼠的生存期明显延长。该模型的建立是评价新的或已有的治疗APL药物和临床前期实验研究的理想模型。第11页/共94页3.3.分化诱导的临床试验分化诱导的临床试验 尽管诱导分化研究取得了成绩，但其最终目的是能应用于临床，ATRA治疗APML能有效地达到临床缓解，被认为是人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范。ATRA能诱导APL病人恶性肿瘤细胞分化成熟，口服AT
12、RA可使大多数患者达到完全临床缓解，即使是传统化疗失败后亦是如此。在欧洲的随机实验证实，ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长生存期。第12页/共94页四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制1.1.核内受体途径核内受体途径 维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径。维甲酸受体(RAR)是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋白，有RARS和RXRS两类，每一类又有、三种类型，比较其DNA序列和结构特点，二者属于类固醇-甲状腺素-vitD3受体在内的核内受体超家族。在细胞液内存在RA结合蛋白，能将RA从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位，自身则释放回到胞浆
13、。RA经胞质内RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位，与核受体以二聚体形式结合某些靶序列，进而引起特定基因的转录激活或转录抑制来诱导细胞分化。第13页/共94页 Manfredini等用ATRA和vitD3诱导白血病母细胞分化实验中发现，M0、M1对二者不敏感，M3在ATRA诱导下向粒细胞方向分化，M2则在二者诱导下向单核细胞分化。进一步研究方发现，ATRA和vitD3有效地增加核内VDR，VDR与RXR形成二聚体，再结合到DR3型VD反应元件，从而激活VD反应元件调控的报告基因的转录，启动了M2向单核细胞方向分化。第14页/共94页 2.影响基因转录影响基因转录 Naka 等等用用9-cis-
14、维维甲甲酸酸诱诱导导胃胃癌癌细细胞胞株株分分化化研研究究中中，发发现现大大多多数数胃胃癌癌细细胞胞株株能能合合成成RARs和和RXRs mRNA，其其中中一一些些细细胞胞株株并并不不停停滞滞于于G0/G1期期，但但可可一一过过性性增增加加p21WAF1蛋蛋白白表表达达，降降低低CDK7、EGFR及及cyclinD蛋蛋白白量量，减减少少Rb基基因因产产物物磷磷酸酸化化。认认为为9-cis-维维甲甲酸酸抑抑制制细细胞胞生生长长是是通通过过调调控控细细胞胞周期，影响维甲酸受体周期，影响维甲酸受体mRNA转录来实现的。转录来实现的。第15页/共94页 Okabe 发发现现TPA可可诱诱导导Ph阳阳性性
15、白白血血病病细细胞胞 MC3向向巨巨核核细细胞胞系系分分化化，血血小小板板糖糖蛋蛋白白GPb表表达达增增强强，GPb mRNA水水平平增增高高，处处理理组组有有GATA-1表表达达，而而GATA-3不不表表达达，未未处处理理组组仅仅GATA-2转转录录。TPA则则通通过过影影响响GPb及及GATAs转转录录来来诱诱导导MC3细胞分化。细胞分化。Garingo在在诱诱导导MEL分分化化中中发发现现红红细细胞胞特特异异性性基基因因转转录录活活化化，PKA缺缺陷陷时时则则转转录录出出现现障障碍碍。转转录录因因子子NF-E2是是提提高高球球蛋蛋白白位位点点控控制制区区活活性性的的必必须须成成分分。DN
16、A与与NF-E2结结合合，-球球蛋蛋白白位位点点控控制制区区增增强强子子活活性性在在PKA缺缺陷陷细细胞胞中中明明显显低低于于具具有有PKA活活性性的的细细胞胞，PKA对对转转录录因因子子的的调调控控影影响响了了红红细细胞胞特特异异基基因因转转录录而诱导而诱导MEL细胞分化。细胞分化。第16页/共94页研究表明，染色质重塑在基因转录调控中有重要作用，而组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因素。我们前期研究的基础上，建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型，以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸钠（Sodiumbutyrate,SB）为阳性对照，观察DADS（diallyldisu
17、lfide）在体内外诱导MGC803细胞分化时，对其核组蛋白乙酰化表达的调控作用，以及二者之间的关系，进一步探讨DADS对MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理。第17页/共94页 H3-actinDADS(mgL-1):15 30 60 30SB(mM):5 5DADS对体外培养对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响细胞组蛋白乙酰化的影响第18页/共94页H4-actinDADS(mgL-1):15 30 60 30SB(mM):5 5DADS对体外培养对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响细胞组蛋白乙酰化的影响第19页/共94页p21WAF1-actin处理时间处理时间（h）
18、:12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24hDADS(mgL-1):0 0 15 15 30 30 60 60DADS对对MGC803细胞细胞p21WAF1蛋白表达的影响蛋白表达的影响第20页/共94页DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响H3-actin各处理因素各处理因素 ：NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1)：66 50 100 200第21页/共94页H4-actin各处理因素各处理因素 ：NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1)：66 50 100 200第22页
19、/共94页DADS对移植瘤细胞对移植瘤细胞p21WAF1表达的影响表达的影响p21WAF1-actin各处理因素各处理因素 ：NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1)：66 50 100 200第23页/共94页3 3.对癌基因和抑癌基因的影响对癌基因和抑癌基因的影响 细细胞胞的的基基因因控控制制细细胞胞的的生生长长与与分分化化，而而这这些些基基因因的的变变化化则则影影响响基基因因的的表表达达或或功功能能被被认认为为是是癌癌变变的的主主要要原原因因。Ras基基因因在在细细胞胞内内有有H-，K-，N-Ras，编编码码分分子子量量为为21kd的的蛋蛋白白，p21Ras蛋蛋白
20、白具具有有GTP酶酶活活性性。Ras能能使使3T3细细胞胞恶恶性性转转化化，促促使使细细胞胞增增殖殖。C-myc过过表表达达可可以以促促进进基基因因转转录录和和细细胞胞分分裂裂，与与肿肿瘤瘤的的形形成成关关系系密密切切。P53基基因因编编码码P53蛋蛋白白，P53蛋蛋白白有有野野生生型型和突变型，野生型和突变型，野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。第24页/共94页 李李晓晓光光等等用用大大蒜蒜油油诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化和和凋凋亡亡研研究究中中，发发现现处处理理组组细细胞胞形形态态接接近近正正常常细细胞胞，细细胞胞的的致致瘤瘤性性明明显
21、显下下降降，Northern杂杂交交有有P53和和P21表表达达增增强强，提提示示大大蒜蒜油油通通过过促促进进抑抑癌癌基基因因P53、P21的的表表达达，抑抑制制细细胞胞恶恶性性增增殖殖、诱诱导凋亡和促进细胞分化。导凋亡和促进细胞分化。王王代代树树等等用用HMBA诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化时时发发现现C-myc和和C-H-ras表表达达抑抑制制。Naka 用用9-顺顺-维维甲甲酸酸诱诱导导胃胃癌癌细细胞胞分分化时则有化时则有P21蛋白一过性增加。蛋白一过性增加。这这些些基基因因在在诱诱导导癌癌细细胞胞分分化化过过程程中中的的改改变变进进一一步步影影响响其其调控的基因表达而实现瘤细胞分
22、化的效应。调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应。第25页/共94页 我我们们发发现现，DADS作作用用下下，MGC803细细胞胞明明显显抑抑制制，且且呈呈剂剂量量-效效应应依依赖赖关关系系；瘤瘤细细胞胞对对Con A的的凝凝集集率率、集集落落形形成成率率与与ALP比比活活性性下下降降；瘤瘤细细胞胞异异形形性性降降低低，核核浆浆比比下下降降，细细胞胞表表面面微微绒绒毛毛数数目目减减少少，胞胞浆浆内内细细胞胞器器丰丰富富，胞胞核核及及部部分分细细胞胞器器呈呈退退行行性性变变，可可见见细细胞胞间间连连接接结结构构；细细胞胞骨骨架架蛋蛋白白合合成成增增加加与与重重组组，细细胞胞间间缝缝隙隙连连接接通通
23、讯讯功功能能恢恢复复，提提示示DADS可可诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化。DADS处处理理后后的的MGC803细细胞胞S期期细细胞胞含含量量减减少少，G2期期细细胞胞含含量量增增加加，细细胞胞停停滞滞于于G2期期，p21WAF1、Rb表达增强，表达增强，p21ras、c-Myc、突变型、突变型p53表达减弱。表达减弱。第26页/共94页 MTT比色实验结果第27页/共94页.DADSDADS对对MGC803MGC803细胞生长的影响细胞生长的影响第28页/共94页倒置显微镜观察MGC803细胞（20）DADS组 （20）第29页/共94页普通光镜观察MGC803细胞 HE（20）DADS
24、处理组 HE（20）第30页/共94页电镜观察微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一，本实验通过微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一，本实验通过透射电镜和透射电镜和Con A凝集性实验证实了凝集性实验证实了MGC803细胞在细胞在DADS处理后，细胞表面微绒毛明显减少，对处理后，细胞表面微绒毛明显减少，对Con A的凝集率下降，的凝集率下降，表明表明MGC803细胞生物学行为表现出恶性性下降。细胞生物学行为表现出恶性性下降。未处理组未处理组MGC803细胞核浆比例大，核仁均质，以细胞核浆比例大，核仁均质，以1-2个个核仁细胞为主；胞质内细胞器稀少，细胞分化程度低。核仁细胞为主；胞质内细胞器稀少，
25、细胞分化程度低。DADS处理的处理的MGC803细胞表面微绒毛减少，细胞核浆细胞表面微绒毛减少，细胞核浆比例下降，胞质内细胞器丰富，有散在的核糖体，细胞核和比例下降，胞质内细胞器丰富，有散在的核糖体，细胞核和线粒体水肿退变，细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连线粒体水肿退变，细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连接结构，细胞分化好接结构，细胞分化好。第31页/共94页第32页/共94页MGC803细胞核浆比例大，核畸形，线粒体水肿（5000倍）第33页/共94页图示DADS组细胞电镜结构第34页/共94页图示DADS组细胞电镜结构第35页/共94页结构的破坏及功能的抑制都是细胞转化早期的异常表现
26、，并与细胞增殖失控及其它恶性行为有关，而微管解聚与DNA合成的启动有关。本实验中观察到DADS处理后，MGC803细胞出现微丝微管合成增加与重组装，呈现规则的放射状分布，提示瘤细胞恶性表型下降，表现为去恶化。第36页/共94页 MGC803细胞骨架 考马丝亮蓝染色（20）DADS组细胞骨架 考马丝亮蓝染色（20）第37页/共94页细胞结构观察MGC803细胞骨架呈弥散荧光 间接免疫荧光染色（100）DADS组细胞骨架阳性，呈黄绿色荧光环绕胞核。间接免疫荧光染色（100）第38页/共94页划痕标记后数分钟即可观察到黄色荧光传播，人胃癌MGC-803细胞不显示荧光染料的传播，表明无间缝隙连接通讯功
27、能。DADS处理后，黄色荧光分布在伤沿细胞列和相邻的数列细胞内，荧光强度从伤沿细胞列到临近数列细胞逐渐减弱，以伤沿细胞列最强，表明间缝隙连接通讯功能恢复。第39页/共94页细胞间缝隙连接通细胞间缝隙连接通讯功能讯功能未处理人胃癌细胞 LuciferYellow10处理组人胃癌细胞 LuciferYellow10第40页/共94页MGC803细胞 (+)p53表达DADS组 ()第41页/共94页p21WAF1表达DADS组 （）MGC803细胞 （）第42页/共94页MGC803细胞 ()DADS组 （）pRb表达第43页/共94页MGC803细胞 （）DADS组 （）p21ras表达第44页
28、/共94页MGC803细胞 (+)DADS组 ()C-Myc表达第45页/共94页裸鼠移植瘤裸鼠移植瘤形成实验形成实验第46页/共94页移植瘤形成实验移植瘤形成实验第47页/共94页表表1.DADS处理后各组裸鼠移植瘤重量变化情况处理后各组裸鼠移植瘤重量变化情况Group Dose(mg/kg)Tumor weight Inhibition rate(%)NS-1.150.23-SB660.440.1461.7 aDADS500.830.1627.8 aDADS1000.390.1166.1 bDADS2000.310.0873.0 b第48页/共94页移植瘤光学显微镜下形态变化移植瘤光学显微
29、镜下形态变化 HE40(A:未处理组；未处理组；B:100mgkg-1DADS处理组处理组)第49页/共94页PCNA-actin各处理因素各处理因素 ：NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1)：66 50 100 200DADS处理移植瘤后处理移植瘤后PCNA蛋白表达蛋白表达第50页/共94页 SSH技术成功构建技术成功构建DADS诱导人胃癌细胞诱导人胃癌细胞MGC803细胞细胞差异表达基因的差异表达基因的cDNA文库。文库。差异表达片段差异表达片段DADS1，长，长208bp，为人类，为人类-synuclein基因部分序列，其上调可能与基因部分序列，其上调可能与DA
30、DS诱导人胃癌诱导人胃癌MGC803细胞分化相关。细胞分化相关。差异表达片段差异表达片段DADS2，长，长272bp，与鱼类，与鱼类hepcidin-like precursor mRNA具有高同源性，其上调可能与具有高同源性，其上调可能与DADS造成造成细胞内低铁低氧环境，继而诱导人胃癌细胞内低铁低氧环境，继而诱导人胃癌MGC803细胞分化细胞分化相关。相关。第51页/共94页 不不同同浓浓度度的的DADS可可显显著著抑抑制制HL-60细细胞胞的的增增殖殖，且且与与药药物物浓浓度度有有明明显显依依赖赖关关系系；0.625-2.5 g/mL时时，NBT还还原原反反应应显显著著增增强强，且且在在
31、1.25gmL-1时时诱诱导导分分化化作作用用达达峰峰值值；DADS小小鼠鼠肾肾囊囊膜膜下下移移植植的的HL-60细细胞胞具具有有显显著著的的生生长长抑抑制制作作用用，并并呈呈剂剂量量依依赖赖关关系系，21 mg/kg 时时抑抑瘤瘤率率达达49.5%；2142mg/kgDADS可可诱诱导导HL-60细细胞胞向向中中性性粒粒系系方向分化。方向分化。DADS对对HL-60细胞作用的研究细胞作用的研究第52页/共94页DADS对对HL-60细胞呈浓度依赖性的生长抑制效应细胞呈浓度依赖性的生长抑制效应第53页/共94页1.25 gmL-1DADS 处理处理HL-60细胞不同时期细胞不同时期NBT还原还
32、原反应的变化反应的变化第54页/共94页未处理的HL-60细胞处理的处理的HL-60 细胞细胞 第55页/共94页DADS对小鼠肾囊膜下HL-60细胞的诱导分化作用第56页/共94页4.4.影响细胞周期蛋白活性影响细胞周期蛋白活性 研研究究者者们们认认为为，细细胞胞周周期期的的失失调调控控是是癌癌症症发发生生发发展展的的原原因因，而而细细胞胞周周期期素素cyclins、细细胞胞周周期期素素依依赖赖性性激激酶酶CDKs及及调调节节CDKs的的激激酶酶和和磷磷酸酸酶酶则则是是细细胞胞周周期期调调控控的的分分子子基基础础。在在真真核核生生物物细细胞胞进进行行有有丝丝分分裂裂时时，其其细细胞胞周周期期
33、可可分分为为间间期期（G1期期、S期期、G2期期）和和M期期，G1期期细细胞胞可可进进入入持持续续时时间间不等的不等的G0期。期。第57页/共94页我们上上述述研研究究结结果果显显示示，pRb、p21表表达达的的增增强强和和c-Myc、Ras及及突突变变型型p53表表达达减减弱弱均均可可导导致致细细胞胞停停滞滞于于G1期期。本本实实验验采采用用流流式式细细胞胞仪仪检检测测了了MGC803细细胞胞在在DADS作作用用后后细细胞胞周周期期的的分分布布，结结果果表表明明细细胞胞停停滞滞于于G2期期而而非非G1期期。DADS可可诱诱导导HL-60细细胞胞表表面面分分化化抗抗原原CD11b表表达达升升高
34、高，CD33表表达达下下降降及及细细胞胞周周期阻滞在期阻滞在G0/G1期。期。第58页/共94页DADS对人胃癌MGC803细胞周期的影响第59页/共94页0gmL-1 DADS 0.625gmL-1 DADS 1.25gmL-1 DADS 2.5gmL-1 DADS5gmL-1 DADS ATRADADS对白血病HL-60细胞周期的影响第60页/共94页DADS对HL-60细胞周期的DNA含量的影响第61页/共94页CD11bCD33DADS对对HL-60细胞表面分化抗原的影响细胞表面分化抗原的影响第62页/共94页流流式式细细胞胞术术检检测测结结果果显显示示经经SB和和100mg/kg、2
35、00 mg/kg DADS作作用用后后，MGC803细细胞胞移移植植瘤瘤细细胞胞G2/M期期百百分分率率分分别别比比NS对对照照组组增增加加1.92、2.22和和3.37倍倍(P0.05)，表表明明DADS呈呈浓浓度度依依赖赖性性对对移植瘤细胞有移植瘤细胞有G2/M期阻滞期阻滞。第63页/共94页不同浓度不同浓度DADS处理后移植瘤细胞周期的变化处理后移植瘤细胞周期的变化 NS组组 SB组组DADS 50mgkg-1组组DADS 100mgkg-1组组 DADS 200mgkg-1组组第64页/共94页 研研究究表表明明，cyclin有有7种种，它它们们的的表表达达随随细细胞胞周周期期时时相相
36、的的转转换换而而发发生生改改变变，不不同同cyclin须须与与相相应应的的CDK结结合合才才能能促促使使细细胞胞周周期期的的完完成成。细细胞胞增增殖殖分分裂裂过过程程中中，cyclins有有如如下下变变化化：细细胞胞由由G0期期进进入入G1期期时时，cyclinD1-3合合成成均均增增加加；G1/S期期时时，cyclinDs及及cyclinE降降解解，cyclinA合合成成增增加加；S期期进进入入G2期期时时，cyclinB合合成成逐逐渐渐增增加加积积累累；G2/M期期转转换换时时，cyclinA、B降降解解，cyclinDs、E合合成成增增加加。cyclinD1在在细细胞胞增增殖殖过过程程中
37、中意意义义最最大大，是是G1期期细细胞胞增增殖殖信信号号的的关关键键蛋蛋白白。许许多多作作者者将将它它视视为为一一种种癌癌基基因因，其其过过度度表表达达可可导导致致细细胞胞增增殖殖失失控控，最最终终形形成成肿肿瘤。瘤。第65页/共94页 CDKs由由CDK1-7 组成，其在细胞周期的特定时间与组成，其在细胞周期的特定时间与相应的相应的cyclin结合后，并经磷酸化或去磷酸化后方具有生物结合后，并经磷酸化或去磷酸化后方具有生物活性，促使与细胞周期有关蛋白的基因表达，从而对活性，促使与细胞周期有关蛋白的基因表达，从而对DNA合成及有丝分裂进行调控。合成及有丝分裂进行调控。G1/S期有不同的期有不同
38、的cyclin/CDK复合体，复合体，cyclinD/CDK4和和cyclinE/CDK2激酶活性是细胞周期激酶活性是细胞周期G1/S期转换所必须的，与期转换所必须的，与cyclinA、E结合的结合的CDK2激酶活性在激酶活性在G1/S期转换时升高，而期转换时升高，而在在M期则降低。期则降低。第66页/共94页CyclinB/cdc2复合体的活性是细胞进入复合体的活性是细胞进入M期所必的，而期所必的，而G1/S期转换，关系到细胞周期的启动，期转换，关系到细胞周期的启动，G2/M期转换则是细期转换则是细胞进行有丝分裂增殖的前提。胞进行有丝分裂增殖的前提。CDIs是是CDKs的负调控因子，可使的负
39、调控因子，可使CDKs失活；失活；cyclins是是CDKs的正调控因子，使的正调控因子，使CDKs活化，二者对活化，二者对CDK活性的活性的影响控制细胞周期各时相的转换。影响控制细胞周期各时相的转换。CDIs可分为两类，一类是可分为两类，一类是P16家族，包括家族，包括P16、P18、P15、P19，特异地抑制，特异地抑制CDK4和和CDK6；另一类是；另一类是P21家族，它包括家族，它包括P21、P27、P57，对，对CDK具有广谱的抑制作用。具有广谱的抑制作用。第67页/共94页 Lee 用用flavopiridol处处理理NSCLC细细胞胞株株NCI-H358时时，发发现现flavop
40、iridol可可使使该该细细胞胞生生长长停停止止和和诱诱导导分分化化，且且分分化化的的启启动动与与cdk2失失活活相相一一致致，western blot分分析析处处理理后后细细胞胞的的有有cyclinE和和D1的的缺缺失失，表表明明CDKs调调控控亚亚单单位位缺缺失失是是CDK2激激酶酶失失活活的的一一个个原原因因，同同样样CDK1、2、5的的抑抑制制剂剂roscovitine也也可可以以诱诱导导NCI-H358细细胞胞分分化化，因因此此诱诱导导分分化化剂剂可可能能通通过过阻抑阻抑CDK2的活性诱导细胞分化。的活性诱导细胞分化。第68页/共94页我们应用我们应用Western blot分析发现
41、，在分析发现，在G2/M期阻滞同时期阻滞同时有有Cdc25C蛋白表达下降，但蛋白表达下降，但CDK1蛋白表达不受蛋白表达不受 DADS 作作用的影响。表明用的影响。表明 DADS对对MGC803细胞的抑制增殖作用与细胞的抑制增殖作用与G2/M期阻滞有关，其分子机理可能与降低期阻滞有关，其分子机理可能与降低Cdc25C蛋白水蛋白水平有关。平有关。p38通路调节通路调节Cdc25C磷酸酶的表达在磷酸酶的表达在DADS诱导诱导MGC803细胞细胞G2/M期阻滞中起着重要作用。期阻滞中起着重要作用。第69页/共94页DADS对人胃癌对人胃癌MGC803和和BGC823细胞细胞G2/M期检查点期检查点激
42、酶通路的影响激酶通路的影响RT-PCR检测Chk1和Chk2在mRNA水平的改变 Western blot检测各蛋白的改变 免疫共沉淀检测Chk1、Chk2与Cdc25C结合 第70页/共94页M123456600bp300bpChk1-actinRT-PCR 检测MGC803、BGC823细胞 Chk1mRNA表达水平 M：Marker；1：MGC803细胞对照组；2-3：DADS 处理MGC803细胞1d、2d；4:BGC823细胞对照组；5-6：DADS 处理BGC823细胞1d、2d第71页/共94页M123456600bp300bpChk2-actinRT-PCR 检测MGC803、
43、BGC823细胞 Chk2mRNA表达水平M：Marker；1：MGC803细胞对照组；23：DADS 处理MGC803细胞1d、2d；4:BGC823细胞；56：DADS处理BGC823细胞1d、2d 第72页/共94页DADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk1和P-Chk1表达 0 1 2 4 8 12 (hr)P-Chk1(Ser345)Chk1-actin DADS对MGC803细胞磷酸化Chk1表达的影响第73页/共94页P-Chk1(Ser345)Chk1-actin DADS对BGC823细胞磷酸化Chk1表达的影响 0 1 2 4 8 12 (hr)第74页/共94页D
44、ADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk2和P-Chk2表达 0 1 2 4 8 12 (hr)P-Chk2Chk2-actin DADS对MGC803细胞磷酸化Chk2表达的影响第75页/共94页0 1 2 4 8 12 (hr)P-Chk2 Chk2-actin DADS对BGC823细胞磷酸化Chk2表达的影响第76页/共94页DADS诱导MGC803和BGC823细胞ATR和P-ATR的表达 0 15 30 60 90 120 (min)P-ATR（Ser428）ATR-actin DADS对MGC803细胞磷酸化ATR表达的影响第77页/共94页0 15 30 60 90 12
45、0 (min)P-ATR（Ser428）ATR-actin 图27 DADS对BGC823细胞磷酸化ATR表达的影响第78页/共94页DADS诱导BGC823细胞Chk下游分子CDC25C、Cyclin B1的表达 0 12 24 36 48 (hr)CDC25C-actinDADS对BGC823细胞Cdc25C磷酸酶表达的影响第79页/共94页 0 12 24 36 48 (hr)Cyclin B1 actin图25 DADS对BGC803细胞CyclinB1表达的影响第80页/共94页免疫共沉淀检测Chk1激酶活性 Chk1Cdc25C MGC803细胞 BGC823细胞 Untreate
46、dTreated by DADS Negative controlUntreatedTreated by DADS Negative control图29 免疫共沉淀Western-blot分析 MGC803和BGC823细胞中的Chk1表达第81页/共94页免疫共沉淀检测Chk2激酶活性 Chk2 Cdc25CNegative controlUntreatedTreated by DADS Negative controlUntreatedTreated by DADS MGC803细胞 BGC823细胞 免疫共沉淀Western-blot分析 MGC803和BGC823细胞中Chk2的表达
47、第82页/共94页Chk1和和Chk2 基因沉默对基因沉默对DADS G2/M期阻滞作用期阻滞作用及检查点激酶通路的影响及检查点激酶通路的影响1.实时荧光定量PCR检测RNAi后Chk1和Chk2 mRNA表达的改变 2.Chk1和Chk2 RNAi后Chk1和Chk2蛋白表达的改变 3.Chk1、Chk2基因沉默后MTT比色实验结果 4.干扰后细胞周期的改变 5.Chk1和Chk2 RNAi后下游蛋白表达的改变 第83页/共94页定量RT-PCR检测MGC803细胞Chk1 mRNA表达的改变样品样品 GAPDH chk1 chk1/GAPDH MGC803 1.03E-01 5.93E-0
48、3 5.76E-02 MGC803+vector 2.02E-01 9.34E-03 4.62E-02 MGC803+DADS 2.93E-01 4.05E-03 1.38E-02 MGC803+DADS+vector 2.98E-01 4.07E-03 1.37E-02 第84页/共94页定量RT-PCR检测BGC823细胞 Chk1 mRNA表达的改变 样品样品 GAPDH chk1 chk1/GAPDH BGC823 1.21E-01 7.59E-03 6.27E-02 BGC823+vector 1.07E-01 6.41E-03 5.99E-02 BGC823+DADS 3.96E-
49、01 3.79E-03 9.57E-03 BGC823+DADS+vector 1.26E-01 1.38E-03 1.1E-02 第85页/共94页定量RT-PCR检测MGC803细胞Chk2 mRNA表达的改变样品样品 GAPDH chk2 chk2/GAPDH MGC803 9.19E-02 3.65E-04 3.97E-03 MGC803+vector 1.03E-01 3.47E-04 3.37E-03 MGC803+DADS 9.08E-02 5.74E-05 6.32E-04 MGC803+DADS+vector 3.13E-01 2.19E-04 7.00E-04 第86页/共
50、94页定量RT-PCR检测BGC823细胞Chk2 mRNA表达的改变样品样品 GAPDH chk2 chk2/GAPDH BGC823 1.07E-01 1.30E-04 1.21E-03 BGC823+vector 1.21E-01 1.44E-04 1.19E-03 BGC823+DADS 2.93E-01 1.10E-04 3.75E-04 BGC823+DADS+vector 2.98E-01 1.12E-04 3.76E-04 第87页/共94页chk1、chk2 RNAi转染MGC803 和BGC823细胞后其mRNA表达 1、2：chk1 RNAi后MGC803、BGC823细