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1、基因工程第二章第1页，本讲稿共53页酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶 S1核酸酶Klenow酶DNA酶 Taq DNA 聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶基因工程操作中最常用的工具酶第2页，本讲稿共53页主要内容主要内容1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 2 DNADNA连接酶连接酶3 3 DNADNA聚合酶聚合酶4 4 修修 饰饰 酶酶5 5 小小 结结第3页，本讲稿共53页酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作
2、DNA探针；2 合成cDNA第二链；3 填补双链DNA 3凹端；4 DNA测序。Taq DNA 聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第4页，本讲稿共53页1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.1 引引 言言1.2 命命 名名1.3 分分 类类1.4 活性及影响因素活性及影响因素Home第5页，本讲稿共53页核酸酶核酸酶（Nuclease）：通过
3、切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分）按作用对象分:DNAase&RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分：）按断裂核酸分子不同方式分：Endonuclease&Exonuclease 1.1 引言引言两个概念两个概念第6页，本讲稿共53页限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（restriction endonuclease):指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸序列，分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链并在识别序列内
4、或附近特异切割双链DNADNA的核酸的核酸内切酶。内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制限制-修饰修饰系统系统（Restriction-Modification System)。Back第7页，本讲稿共53页1.2 命命 名名命名原则：命名原则：第一个字母第一个字母（大写（大写,斜体斜体）：）：该酶来源的微生物该酶来源的微生物属名属名；第二、三个字母第二、三个字母（小写、（小写、斜体斜体）：微生物）：微生物种名种名；若该微生物有不同的若该微生物有不同的变种和品系变种和品系，再加上该变种和品系的，再加上该变种和品系的第一个字母第一个字母（大写）（大写）若从同一微
5、生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后先后顺序用罗马字母表示顺序用罗马字母表示。例如：例如：EcoR 从大肠杆菌从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为株分离的第一种限制酶命名为EcoR，其中其中E 代表属名（代表属名（Escherichia)，co 代表种名（代表种名（coli)，R 代表株系代表株系（RY13），），代表该菌株中首次分离到。代表该菌株中首次分离到。Back第8页，本讲稿共53页1.3 分分 类类1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶
6、Back第9页，本讲稿共53页1.3.1 1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶功能：功能：限制、修饰限制、修饰特点：特点：需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助辅助因子；因子；识别位点和切割位点不一致，无识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；固定切割位点；应用：应用：不常用。不常用。Back第10页，本讲稿共53页1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶功能：功能：限制、修饰限制、修饰特点：特点：需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助因子；辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点特异切割，切割位点在距识别位点33端
7、端24-26 bp24-26 bp处。处。应用：应用：数量很少，无实际作用。数量很少，无实际作用。Back第11页，本讲稿共53页1.3.3 1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割识别并特异切割DNADNA分子。分子。即通常所指即通常所指DNADNA限制性核酸内切酶；限制性核酸内切酶；反应特点：反应特点：仅需仅需 MgMg2+2+作催化反应辅助因子，能作催化反应辅助因子，能识别双链识别双链DNADNA特殊序列，并可特异切割特殊序列，并可特异切割DNADNA，产，产生特异片段；生特异片段；应用：应用：种类繁多，分子克隆中最为常用种类繁多，分子克隆中最为常用第12页，本
8、讲稿共53页(1)基本特性基本特性识别长度为识别长度为4-84-8个核苷酸的特异序列；个核苷酸的特异序列；许多识别序列具许多识别序列具回文结构回文结构(两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列)，如，如HinHind d 的识别序列：的识别序列：5 AAGCTT 35 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCGAA 5切割产生末端有切割产生末端有粘端粘端 (cohesive/sticky end)(cohesive/sticky end)如如BamBamH I(GGATCC)H I(GGATCC)和和平端平端 (blunt end)(blunt end)如如SmaSma I(CCC
9、GGG)I(CCC GGG)第13页，本讲稿共53页粘性末端粘性末端(1)3-OH单链延伸的粘性末端单链延伸的粘性末端.如：如：Pst 5-CTGCA G-3 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5(2)5-P单链延伸的粘性末端单链延伸的粘性末端.如：如：EcoR 5-G AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 平末端平末端 如如:Sma 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5第14页，本讲稿共53页EnzymeRecognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBa
10、mH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 第15页，本讲稿共53页(2)同功异源酶同功异源酶(isoschizomer)来源不同但能识别
11、和切割同一位点的酶。又来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。称同裂酶。如：如：BamH I(GGATCC)和和Bst I(G GATCC)注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。化碱基的敏感度有所不同。第16页，本讲稿共53页(3)同尾酶（同尾酶（isocaudamer)识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。如：如：BamH I:GGATCC Bgl II:AGATCTBack第17页，本讲稿共53页1.4 1.4 活性及影响因素活性及影响因素(1)活性大小：酶对活性大小：酶
12、对DNA水解程度不同。水解程度不同。(2)酶的活性单位：酶的活性单位：指指1g 纯的指定纯的指定DNA在指定缓冲液中，于在指定缓冲液中，于37（最适最适温度更准确温度更准确）酶解）酶解1 h完全酶解完全酶解DNA中所有中所有同一限制同一限制性内切酶位点性内切酶位点所需的酶量。所需的酶量。第18页，本讲稿共53页(3)影响因素影响因素 DNA模板的纯度模板的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应温度酶切反应温度 DNA的分子结构的分子结构 缓冲液缓冲液Back第19页，本讲稿共53页2 DNA连接酶连接酶2.1 定义及功能定义及功能2.2 种类及作用机理种类及作用机理2.3 使用时的注意
13、事项使用时的注意事项Home第20页，本讲稿共53页2.1 定义及功能定义及功能 DNADNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）：）：可使一段可使一段DNA 3-OHDNA 3-OH末端和末端和5-P 5-P 末端形末端形成成3,5-3,5-磷酸二酯键，把两磷酸二酯键，把两DNADNA片段连在片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。一起封闭双链上形成的切口的酶。第21页，本讲稿共53页OH P53355335DNA ligaseDNA ligase DNA ligase 连接缺刻连接缺刻(nick)(nick)Back第22页，本讲稿共53页 两类两类:T4 DNA连接酶
14、连接酶(ATP提供能量）提供能量）大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶（连接酶（NAD+提供能量）提供能量）2.2 种类及作用机理种类及作用机理第23页，本讲稿共53页T4 DNA ligase 的作用机理的作用机理Back第24页，本讲稿共53页1)1)不能催化两单链不能催化两单链DNADNA分子连接；分子连接；2)2)只能连双链只能连双链DNADNA分子的单链缺刻分子的单链缺刻(nick)(nick)；不能连；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)(gap)。2.3 使用时的注意事项使用时的注意事项第25页，本讲稿共53页DNA ligase 的活
15、性的活性Back第26页，本讲稿共53页3 DNA3 DNA聚合酶聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）3.1 DNA聚合酶聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶3.4 逆转录酶逆转录酶3.5 T4 DNA聚合酶聚合酶3.6 T7 DNA聚合酶聚合酶Home第27页，本讲稿共53页3.1 DNA聚合酶聚合酶 活性：活性：5353聚合活性，聚合活性，5353外切和外切和35 35 外切活性。外切活性。发挥生物学活性的条件：发挥生物学活性的条件：（1 1）DNADNA模板（可以是单链或双链）模板（可以是单链或双链）（2 2）带有）带
16、有3-3-端游离羟基的引物链端游离羟基的引物链（3 3）底物和激活剂）底物和激活剂注：注：对双链对双链DNADNA，当有，当有dNTPdNTP存在时，存在时，3535降解活降解活性会被性会被5353方向的聚合活性所抑制。方向的聚合活性所抑制。应用：应用：缺口平移法制备缺口平移法制备DNADNA分子杂交探针分子杂交探针第28页，本讲稿共53页缺口缺口DNase IDNA聚合酶聚合酶 IDNA聚合酶聚合酶 IdNTP*缺口缺口缺口平移法制备缺口平移法制备DNADNA分子探针分子探针Back第29页，本讲稿共53页活性：活性：53聚合活性，聚合活性，35 外切酶活性，无外切酶活性，无53 外切酶活性
17、。外切酶活性。用途：用途：（1）填补或标记）填补或标记DNA的的3隐蔽末端；隐蔽末端；（2）催化合成）催化合成cDNA第二链；第二链；（3）DNA序列测定序列测定3.2 Klenow聚合酶聚合酶第30页，本讲稿共53页EcoR I 酶切末端酶切末端同位素标记的同位素标记的EcoR I 酶切末端酶切末端-32P-dATPBack第31页，本讲稿共53页显著特点：显著特点：热稳定性。热稳定性。7070反应反应2h2h残留活性残留活性90%90%；93 93 反应反应 2 h2 h残留活性残留活性60%60%；94 94 反应反应 2 h2 h残残留活性留活性40%40%。应用：应用：（1 1）对）
18、对DNADNA的特定片段进行体外扩增；的特定片段进行体外扩增；（2 2）DNADNA序列测定。序列测定。3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶Back第32页，本讲稿共53页逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)：又称又称RNA指导下的指导下的DNA聚合酶。聚合酶。活性：活性：53聚合酶活性和聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作活性。聚合作用所需模板可以是用所需模板可以是RNA或或DNA，引物是带，引物是带3-OH的的RNA或或DNA。3.4 3.4 逆转录酶逆转录酶第33页，本讲稿共53页逆转录酶的活性逆转录酶的活性第34页，本讲稿共53页 用途：用途：（1）在体外以）在
19、体外以mRNA为模板合成为模板合成cDNA；（2）对有）对有5突出末端的突出末端的DNA片段作末端标记片段作末端标记（补平）；（补平）；（3）双脱氧法测序；）双脱氧法测序；（4）以）以DNA或或RNA为模板合成核酸探针。为模板合成核酸探针。Back第35页，本讲稿共53页活性：活性：53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性，外切酶活性，且且35外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNA的作用比对的作用比对双链双链DNA强。强。高浓度高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。环竟下前者活性更强。应用：应用：标记标记DNA平末端或隐蔽平末端或隐蔽3末端末端3.5 T4 DNA3.5 T4 DNA聚合酶聚合
20、酶Back第36页，本讲稿共53页活性：活性：53聚合酶活性；有单链及双链的聚合酶活性；有单链及双链的35外切酶活性，但无外切酶活性，但无53外切酶活性；外切酶活性；特点：特点：极佳的连续合成能力极佳的连续合成能力应用：应用：（1）用于长模板）用于长模板DNA的引物延伸反应；的引物延伸反应；（2）通过单纯延伸或取代合成途径标记通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA 3末端；末端；（3）使双链）使双链DNA 5或或3突出末端变平末端。突出末端变平末端。3.6 T7 DNA聚合酶聚合酶Back第37页，本讲稿共53页4 4 修饰酶修饰酶4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶4.2 末端转移酶末端转移酶4.3
21、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4 S1核酸酶核酸酶 Home第38页，本讲稿共53页4.1 4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶功能：功能：催化核酸脱催化核酸脱5-磷酸基团，使磷酸基团，使DNA或或RNA片段片段5-P末端转末端转换成换成5-OH末端。末端。来源：来源：大肠杆菌：大肠杆菌：bacterial alkaline phosphatase(BAP);小牛肠道小牛肠道:calf intestinal alkaline phosphatase(CIP)。第39页，本讲稿共53页碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶的活性第40页，本讲稿共53页 注意：注意：CIPCIP的比活性比的比活性比BAPBAP高出
22、高出10-2010-20倍，且倍，且CIPCIP在在SDSSDS中中6868就可完全失活，就可完全失活，而而BAPBAP却是热抗性酶。却是热抗性酶。Back第41页，本讲稿共53页来源来源:前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：功能：催化催化DNA进行进行53方向的聚合作用方向的聚合作用,逐个逐个将将dNTP分子加到线性分子加到线性DNA分子分子3-OH端端。4.2 4.2 末端转移酶末端转移酶 (terminal transferase)第42页，本讲稿共53页末端转移酶的催化作用末端转移酶的催化作用第43页，本讲稿共53页 用途：用途：(1)(1)(主要
23、主要)给外源给外源DNADNA片段和及载体加互补片段和及载体加互补同聚物尾巴；同聚物尾巴；(2)(2)标记标记DNADNA片段的片段的33末端。末端。Back第44页，本讲稿共53页4.3 T44.3 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase(PNK)来源来源:T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。噬菌体感染的大肠杆菌细胞。功能：功能：催化催化-磷酸从磷酸从ATP分子转移给分子转移给DNA或或RNA的的5-OH末端（图）。末端（图）。第45页，本讲稿共53页T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应）多核苷酸激酶的活性（正向反应）第46页，本讲稿共53页DNA/RNADNA
24、/RNA（单链或双链）（单链或双链）T4T4多核苷酸激酶的交换活性多核苷酸激酶的交换活性过量过量第47页，本讲稿共53页 用途：用途：（1）标记）标记DNA的的5-末端；末端；（2）使缺失）使缺失5-P末端的末端的DNA发生发生磷酸化作用。磷酸化作用。Back第48页，本讲稿共53页4.4 4.4 S1S1核酸酶核酸酶来源：来源：来源于稻谷曲霉来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）功能：特异单链核酸内切酶功能：特异单链核酸内切酶注意：注意：对双链对双链DNADNA、双链、双链RNARNA和和DNA-RNADNA-RNA杂交体杂交体不敏感。不敏感。第49页，本讲稿共53页S1S1
25、核酸酶的活性核酸酶的活性第50页，本讲稿共53页 用途：用途：(1)(1)测定真核基因中间隔子序列位置测定真核基因中间隔子序列位置；(2)(2)去除去除DNADNA片段中突出的单链尾巴片段中突出的单链尾巴；(3)(3)打开打开cDNAcDNA合成时形成的发夹环结构合成时形成的发夹环结构。Back第51页，本讲稿共53页特性 分类型型型酶分子三亚基双功能内切酶和甲基化酶分开二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-6 bp，大多数为回文结构5-7 bp非对称序列切割位点距识别位点至少400 bp，无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点24-26 bp 处限制性反应与甲基化反应互斥分开的反应同时
26、竞争限制作用所需的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸DNA重组中用途无有无各类限制性核酸内切酶的特性各类限制性核酸内切酶的特性第52页，本讲稿共53页参考书籍参考书籍.Molecular Cloning 2005 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 2.基因工程原理第二版（上册）基因工程原理第二版（上册）吴乃虎科学出版社吴乃虎科学出版社2006 3.分子生物学试剂产品目录分子生物学试剂产品目录如如 New England BioLabs 其它基因及其操作原理其它基因及其操作原理精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南Internet 第53页，本讲稿共53页