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1、参考书参考书:1.1.基因工程孙明基因工程孙明 高高等教化出版社等教化出版社2.2.基因工程原理基因工程原理 吴吴乃虎乃虎 科学出版社科学出版社3.3.分子克隆试验指南分子克隆试验指南 J.Sambtook,EF Frish,J.Sambtook,EF Frish,T Maniatis.T Maniatis.金冬雁等译，金冬雁等译，科学出版社科学出版社4.4.英国英国 Principles of Principles of Gene Manipulation Gene Manipulation 5.5.基因操作原理基因操作原理 中文中文版版 瞿礼嘉、顾红雅瞿礼嘉、顾红雅 译译 高等教化出版社高
2、等教化出版社原理：通过基因重组原理：通过基因重组原理：通过基因重组原理：通过基因重组,让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。操作水平：操作水平：操作水平：操作水平：DNADNADNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所须要的品种。结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所须要的品种。结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所须要的品种。结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所须要的品种。利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分别感爱好的基因，或是
3、用人工合成的方法获得基因，然后经过一系列切割，加工修饰，经连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞（转化），以期获得基因表达的过程。什么是基因工程什么是基因工程?基因工程基因工程(gene engineering)常和以下名称混用常和以下名称混用n遗传工程遗传工程(genetic engineering);n基因克隆基因克隆(gene cloning);n分子克隆分子克隆(molecular cloning);n基因操作基因操作(gene manipulation);n重组重组DNA技术技术(recombination DNA technique)n克隆克隆(clone):作名词时
4、指含有某目的作名词时指含有某目的DNA片段的片段的重组重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。分子或含有该重组分子的无性繁殖系。n作动词时是指基因的分别与重组过程。作动词时是指基因的分别与重组过程。血液血液 供血者供血者 受血者受血者 注射器注射器 目的基因目的基因 供体供体 受体受体 载体载体基因工程（打比方）基因工程（打比方）将供体或在细胞外产生的将供体或在细胞外产生的核酸（物质）分子核酸（物质）分子插入到病毒插入到病毒(virus)、质粒、质粒(plasmid)或或其它载体系统其它载体系统(vecter system)中中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体从而形成一种新的可连续繁殖的
5、有机体再整合到那些原来不含该类物质的宿主再整合到那些原来不含该类物质的宿主(host)受体中受体中基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展2020世纪世纪7070年头，年头，Paul Paul BergBerg及其同事第一个创及其同事第一个创建重组建重组DNADNA分子分子Paul BergPaul Berg基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展19731973年年,美国美国 Herber Herber BoyerBoyer教授和教授和StanleyStanley CohenCohen教授在人类历教授在人类历史上第一次进行了有史上第一次进行了有目的的基因重组尝试，目的的基因重组尝试，并据此提
6、出了并据此提出了“基因基因克隆克隆”的策略。的策略。Herbert W.Boyer,Ph.D.基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展19751975，发觉发觉分子克隆工具分子克隆工具酶酶利用限制性内切利用限制性内切酶（酶（RestrictionRestrictionendonucleaseendonuclease）切）切割产生特殊割产生特殊DNADNA片段的实力使得片段的实力使得纯化那些纯化那些DNADNA片片段成为可能段成为可能基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展19781978年，重年，重组胰胰岛素素19791979年，人年，人类生生长激素激素基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展
7、Firsttransgenicanimal,thegoldencarp,isclonedbyChinesescientistsin1981.Canadas first biotechnology company,Allelix,isformedin1995.nToday Biotechnology has made a great impact in agriculture,medicine,food and many other products.基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展什么是基因什么是基因?编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DN
8、A序列。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。nDNAexon1intron1exon2intron2exon3intron3exon4转录Pro-mRNAmRNA剪接翻译蛋白质 真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系生物进化的分子基础生物进化的分子基础 基因基因用进废退，获得性遗传用进废退，获得性遗传达尔文进化论达尔文进化论拉马克进化论拉马克进化论过度繁殖，生存斗争过度繁殖，生存斗争遗传和变异，适者生存遗传和变异，适者生存基因工程的优点打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，
9、可打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、人与其他生物之间的遗传信息相互重组和转移。人与其他生物之间的遗传信息相互重组和转移。为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上？这种嫁接时如何实现的？基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可转移的多肽与基因之间有对应关系遗传密码通用基因可以复制遗传基因工程探讨的理论依据3 3起始密码子起始密码子5 5腺嘌呤（腺嘌呤（A A）胸腺嘧啶）胸腺嘧啶（T T）胞嘧啶（）胞嘧啶（C C）鸟嘌呤）鸟嘌呤（G G）（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组D
10、NA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培育，获得所需的遗传性状或表达出所须要的产物。重组重组DNA操作一般步骤操作一般步骤生物材料生物材料mRNADNARNAcDNA 文库文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成目的基因目的基因克隆载体克隆载体受体细胞受体细胞重组重组DNA克隆子克隆子转基因生物转基因生物基因工程操作的工具限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.1.将目的基因片断从受体细胞内提取，将目的基因片断从受体细胞内提取，2.2.须要基因的剪刀须要基因的剪刀限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶。
11、3.3.将目的基因与质粒将目的基因与质粒DNADNA连接，连接，4.4.须要基因的针线须要基因的针线DNADNA连接酶。连接酶。5.5.将目的基因运入大肠杆菌，将目的基因运入大肠杆菌，6.6.须要基因的运输工具须要基因的运输工具运载体。运载体。n限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease）n定义定义n是一类能识别双链是一类能识别双链DNADNA中特殊的核苷酸序列，中特殊的核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。核糖核酸酶。n类型类型n型限制酶型限
12、制酶n型限制酶型限制酶nIIIIII型限制酶型限制酶限制性内切酶的命名型限制酶的特性 识别序列识别序列6个：个：如：如：Not 5-GCGGCCGC-3（8个）个）6个（大多数）：个（大多数）：如：如：EcoR 5-GAATTC-3有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。如：如：Sau3A识别识别：GATC BamH识别识别：GGATCC有的限制酶识别多种核苷酸序列。有的限制酶识别多种核苷酸序列。如：如：Hind识别识别 4种核苷酸序列：种核苷酸序列：5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基嘧啶碱基C或或T；Pu 嘌呤碱基嘌呤碱基A或或G）GGGGA A
13、T TCCCCCCCCT TA AGGGG5353限制酶：限制酶：BamH 结构相同，方向相反的重复序列，正读与反读都相同。结构相同，方向相反的重复序列，正读与反读都相同。旋转对称或左右互补对称结构。旋转对称或左右互补对称结构。为便于书写，识别序列可以以为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链走向的单链DNA表示。表示。型限制酶的特性 II型限制酶的识别序列一般都具有回文结构型限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome)(palindrome)GTGTNNA AC CCACANNTGTG5353(a)5P单链延长的粘性末端单链延长的粘性末端(b)3OH单链延长的粘性末端单链延长
14、的粘性末端粘性末端（粘端）粘性末端（粘端）G AATTCCTTAA GGAATTCCTTAAG如：如：Eco R53535353CTGCA GG ACGTCCTGCAGGACGTC如：如：Pst 53535353各种限制酶的切割类型是各种各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；型限制酶的切割类型 平头末端（平端）平头末端（平端）CCC GGGGGG CCCCCCGGGGGGCCC如：如：Smal 53535353各种限制酶的切割类型是各种各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；型限制酶的切割类型 G A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A GG A
15、 A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A GG G C T T A AC T T A A A A T T CA A T T C G GG G C T T A AC T T A A A A T T CA A T T C G G被同一种限制酶切断的几个DNADNA是否具有相同的黏性末端？用同种限制酶切割用同种限制酶切割同尾酶（同尾酶（isocaudamer）有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然来来源源各各异异，识识别别的的靶靶子子序序列列也也各各不不相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，这这一一类类限限制制酶酶特特称称为为
16、同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性末端称为性末端称为配伍未端配伍未端。Bam Bam HHBglBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A同尾酶和同裂酶同尾酶和同裂酶同裂酶（同裂酶（isoschizomer）有有一一些些来来源源不不同同的的限限制制酶酶识识别别的的是是同同样样的的核核苷苷酸酸靶靶序序列列，这这类类酶酶特特称称为为同同裂裂酶酶。同同裂裂酶酶的的切切点点位位置置可可相同或不同。相同或不同。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC
17、 G+Bst（a）切点位置相同）切点位置相同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGG C+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma（b）切点位置不相同）切点位置不相同同裂酶（同裂酶（isoschizomer）有有一一些些来来源源不不同同的的限限制制酶酶识识别别的的是是同同样样的的核核苷苷酸酸靶靶序序列列，这这类类酶酶特特称称为为同同裂裂酶酶。同同裂裂酶酶的的切切点点位位置置可可相同或不同。相同或不同。单酶切法单酶切法双酶切法双酶切法部分酶切部分酶切DNA分子片段化自然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。HinHind d
18、IIIIIISalSal I I1 1、具有互补粘性末端片段的连接具有互补粘性末端片段的连接2 2、具平末端、具平末端DNADNA片段之间的连接片段之间的连接3 3、DNADNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接4 4、DNADNA片段加杆后连接片段加杆后连接 DNADNA片段连接 E.coli DNA 连接酶连接酶只能催化互补粘性只能催化互补粘性末端之间的连接末端之间的连接DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。T4 DNA 连接酶连接酶催化互补粘性末端和催化互补粘性末端和平末端之间的连接，平末
19、端之间的连接，但平末端之间连接的但平末端之间连接的效率比较低效率比较低。具有互补粘性末端片段的连接具有互补粘性末端片段的连接 E.coli DNA 连接酶连接酶具有互补粘性末端和平末端片段的连接具有互补粘性末端和平末端片段的连接EcoRIEcoRI T4 DNA 连接酶连接酶末端转移酶+核酸外切酶+DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接核酸外切酶核酸外切酶（exonuclease）：在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶的修饰作用CTAGAAGC共同的限制性内切酶酶切位点共同的限制性内切酶酶切位点DNADNA连接酶连接酶DNA片段末端加杆后连接
20、片段末端加杆后连接外切酶修饰外切酶修饰酶切酶切要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是运载体运载体运载体运载体1 1 1 1、条件：、条件：、条
21、件：、条件：含有限制性内切酶的位点含有限制性内切酶的位点含有限制性内切酶的位点含有限制性内切酶的位点能自我复制能自我复制能自我复制能自我复制含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因能启动外源目的基因的转录和翻译能启动外源目的基因的转录和翻译能启动外源目的基因的转录和翻译能启动外源目的基因的转录和翻译能在宿主细胞内复制并稳定地保存能在宿主细胞内复制并稳定地保存能在宿主细胞内复制并稳定地保存能在宿主细胞内复制并稳定地保存2 2 2 2、种类、种类、种类、种类质粒、噬菌体、病毒、不同质粒、
22、噬菌体、病毒、不同质粒、噬菌体、病毒、不同质粒、噬菌体、病毒、不同DNADNADNADNA片段组合载体片段组合载体片段组合载体片段组合载体质粒是能自主复制的质粒是能自主复制的双链环状双链环状DNADNA分子分子质粒克隆载体质粒克隆载体大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体可以克隆可以克隆10kb以下以下的片段的片段细菌人工染色体细菌人工染色体克隆载体克隆载体一般在一般在10kb10kb以下，以下，能承载能承载40kb40kb左右左右的外源片段。的外源片段。其他种类的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、真核表达载体、昆虫细胞
23、载体、酵母表达载体、体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、报告基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建载体、噬菌体展示载体载体种类载体种类基因操作的基本步骤1.1.获得目的基因获得目的基因获得目的基因获得目的基因2.2.形成重组形成重组形成重组形成重组DNADNADNADNA分子分子分子分子3.3.将重组将重组将重组将重组DNADNADNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞分子导入受体细胞分子导入受体细胞4.4.4.4.4.4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞5.5.5.5.
24、5.5.目的基因的表达目的基因的表达目的基因的表达目的基因的表达将须要的基因从供体生物的细胞内提取出来将须要的基因从供体生物的细胞内提取出来取出取出取出取出DNADNADNADNA用限制酶用限制酶用限制酶用限制酶切断切断切断切断DNADNADNADNA 目前被较广泛提取目前被较广泛提取目前被较广泛提取目前被较广泛提取运用的目的基因有：苏运用的目的基因有：苏运用的目的基因有：苏运用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基基
25、因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法提取目的基因的方法1 1、干脆分别基因、干脆分别基因细胞内总DNA的提取分别程序双链DNA加热至90-95变性解旋成为单链DNA，成为互补链聚合反应的模版降温至37-60与模版复性结合升温至70-75，DNA聚合酶催化引物按5-3延长，合成模版DNA链的互补链N个循环，达到个循环，达到2n的拷贝数的拷贝数 2 2、利用、利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因PCR原理原理 2 2、利用、利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因引物引物1 目的基因目的基因 已
26、知序列已知序列已知序列已知序列 引物引物2PCR扩增扩增含有目的基因的含有目的基因的DNA片段片段1、必需知道待扩增目的基因必需知道待扩增目的基因DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列2、待扩增片段两端长约、待扩增片段两端长约20bp的序列已知，的序列已知，3、允许扩增的、允许扩增的DNA片段长度一般在片段长度一般在1kb以内以内4、扩增未知序列或长达几千扩增未知序列或长达几千bp的大基因，须要特殊类型的的大基因，须要特殊类型的PCR策略策略5、RT-PCR、免疫、免疫PCR、巢式、巢式PCR、实时荧光、实时荧光PCR、原位、原位PCR技术等技术等30几种几种PCR之歌从前你要扩增DNA，总有
27、培育大批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫KaryMullis博士的，他钻出来说体外合成也OK！只消把你的模板混上缓冲液，再加些引物核苷和聚合酶。变性，退火，和延长。加热凉凉加热新颖 妙！当你想要检测突变，来啊，做PCR吧！当你想要基因重组，来啊，做PCR吧！当你想要侦破大案，来啊，做PCR吧！当你想知道孩子他爹究竟是哪个混蛋，来啊，做PCR吧！Bio-rad推出的ScientistsforbetterPCR 3 3、人工基因合成法、人工基因合成法1.1.1.1.干脆合成法：已知某基因的序列的前干脆合成法：已知某基因的序列的前干脆合成法：已知某基因的序列的前干脆合成法：已知某基因的序列的前提下提
28、下提下提下,可以用化学方法合成或用可以用化学方法合成或用可以用化学方法合成或用可以用化学方法合成或用PCRPCRPCRPCR技技技技术扩增获得目的因术扩增获得目的因术扩增获得目的因术扩增获得目的因.(.(.(.(如胰岛素基因如胰岛素基因如胰岛素基因如胰岛素基因)2.2.2.2.逆转录法逆转录法逆转录法逆转录法:以信使以信使以信使以信使RNARNARNARNA为模板，在逆转为模板，在逆转为模板，在逆转为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(DNA(DNA(DNA(基因基因基因基因)。3.
29、3.3.3.依据蛋白质的氨基酸依次推算出信使依据蛋白质的氨基酸依次推算出信使依据蛋白质的氨基酸依次推算出信使依据蛋白质的氨基酸依次推算出信使RNARNARNARNA核苷酸依次，再据此推算出基因核苷酸依次，再据此推算出基因核苷酸依次，再据此推算出基因核苷酸依次，再据此推算出基因DNADNADNADNA的脱氧核苷酸依次。用游离脱氧的脱氧核苷酸依次。用游离脱氧的脱氧核苷酸依次。用游离脱氧的脱氧核苷酸依次。用游离脱氧核苷酸干脆合成相应的基因。核苷酸干脆合成相应的基因。核苷酸干脆合成相应的基因。核苷酸干脆合成相应的基因。DNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪PCRPCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪535353
30、535353*磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化退火退火连接连接退火退火连接连接退火退火连接连接粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端合成的全基因合成的全基因DNA目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合-形成重组形成重组DNADNA提取质粒并用提取质粒并用限制酶切割限制酶切割用用用用连接酶将目的连接酶将目的基因和质粒连接基因和质粒连接用限制酶切割目的基因和用相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子n基因工程中
31、常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。如用质粒作运载体,则选大肠杆菌为受体细胞n目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。将目的基因导将目的基因导将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞进行扩增进行扩增进行扩增进行扩增将重组将重组DNADNA导入受体细胞并扩增导入受体细胞并扩增将重组将重组DNADNA导入受体细胞并扩增导入受体细胞并扩增将目的基因导将目的基因导将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞进行扩增进行扩增进行扩
32、增进行扩增转化：外源袒露转化：外源袒露DNADNA进入受体细胞，并在受进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。转染：假如外源转染：假如外源DNADNA分子是病毒或者噬菌体分子是病毒或者噬菌体DNADNA或或RT-DNART-DNA，那么把此过程也称为转染。，那么把此过程也称为转染。化合物诱导转化：感受态细胞化合物诱导转化：感受态细胞电穿孔转化：高电压脉冲产生瞬间通道电穿孔转化：高电压脉冲产生瞬间通道超声波处理转化：击穿细胞膜形成膜通道超声波处理转化：击穿细胞膜形成膜通道脂质体介导转化：磷质双层包袱脂质体介导转化：磷质双层包袱DNA磷酸钙转
33、染法：动物细胞捕获磷酸钙转染法：动物细胞捕获DNA-磷酸钙沉淀物磷酸钙沉淀物常用转化法常用转化法筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞 前三步的处理特别繁锁，为保证目的前三步的处理特别繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必需将它从中检测出来。必需将它从中检测出来。受体细胞是否具运载体特有的受体细胞是否具运载体特有的受体细胞是否具运载体特有的受体细胞是否具运载体特有的“标记基因标记基因标记
34、基因标记基因”所限制所限制所限制所限制的性状的性状的性状的性状检测依据检测依据检测依据检测依据1、依据载体抗性基因和相应的药物筛选转化子2、依据报告基因筛选转化子3、依据噬菌斑筛选转化子重组子的鉴定重组子的鉴定1、依据重组DNA分子特征鉴定u 依据重组DNA分子大小u 酶切图谱u PCR扩增片段鉴定u DNA杂交法鉴定：Southernu 杂交，斑点印迹杂交，菌落（噬菌体）原位杂交u 应用DNA芯片鉴定u 依据DNA核苷酸序列鉴定DNA=琼脂糖电泳=印迹转移=预杂交=杂交（变性探针）=洗膜=放射自显影或显色重组子的鉴定重组子的鉴定2、依据目的基因转录产物（mRNA）鉴定Northern杂交：用DNA探针检测RNA分子mRNA提取提取=甲醛变性电泳甲醛变性电泳=印迹转移印迹转移=预杂交预杂交=杂交（变性探针）杂交（变性探针）=洗膜洗膜=放射自显影或化学发光放射自显影或化学发光3、依据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定重组子的鉴定重组子的鉴定 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛总体技术路途总体技术路途基因工程的应用基因工程的应用第一次测验题目：简述基因工程探讨的基本技术路途