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1、 培养基的选择 依据依据:经验、文献、尝试经验、文献、尝试 常用常用:RPMI1640:RPMI1640、DMEMDMEM 培养基的来源 市售干粉培养基市售干粉培养基-自己配制自己配制 液体培养基液体培养基-直接使用直接使用(注意有效期注意有效期)第1页/共27页培养基的除菌方法 过滤除菌过滤除菌:(1):(1)正压过滤正压过滤-效率高效率高 (2)(2)负压过滤负压过滤-效率低效率低 高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌:不不含含谷谷氨氨酰酰胺胺，灭灭菌菌后后另另外外添添加加培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加按使用说明或实验要求添加 配制时加配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等碳酸氢钠、抗生素
2、、血清等 临用前加临用前加:生物活性因子如生物活性因子如EGFEGF、FGFFGF、NGFNGF、PDGFPDGF等等 第2页/共27页RPMI1640RPMI1640培养液配制过程培养液配制过程 准备物品 (1)(1)不不锈锈钢钢过过滤滤器器,滤滤膜膜(0.45m,0.22m),(0.45m,0.22m),磁磁力力搅搅拌拌器器,天天平平,烧烧杯杯,量筒量筒,盐水瓶盐水瓶 (2)(2)培培养养粉粉,1N,1N HCl,NaHCOHCl,NaHCO3 3,青青霉霉素素,链链霉霉素素,胎牛血清胎牛血清,新鲜三蒸水新鲜三蒸水 消毒物品 滤滤器器中中放放置置0.45m0.45m和和0.22m0.22m
3、滤滤膜膜,包包装装,高压蒸气消毒高压蒸气消毒第3页/共27页配制步骤配制步骤(1)(1)10.4g/10.4g/包包培培养养粉粉溶溶至至1L1L三三蒸蒸水水中中,磁磁力搅拌力搅拌20min20min(2)(2)加加2g NaHCO2g NaHCO3 3/L,/L,继续搅拌继续搅拌10min10min(3)(3)加加青青霉霉素素100U/mL(80100U/mL(80万万U U溶溶至至4ml4ml三三蒸蒸水水,取取0.5ml)0.5ml)链链霉霉素素100U/mL(100100U/mL(100万万U U溶溶至至5ml5ml三三蒸蒸水水,取取0.5ml)0.5ml)(4)(4)加加1N 1N HC
4、lHCl约约3mL,3mL,调调pHpH至至7.2,7.2,继继续续搅搅拌拌第4页/共27页(5)(5)按按要要求求加加血血清清（血血清清一一般般需需经经5656，30min30min灭活）灭活）例如例如:10%:10%胎牛血清胎牛血清 无血清培养液无血清培养液 900ml900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清 100ml100ml(6)(6)正正压压过过滤滤除除菌菌 (气气压压适适当当,防防止止滤滤膜膜破破裂裂)(7)(7)分装分装,贮存于贮存于44，2 2周内用完。周内用完。(8)(8)无无菌菌试试验验:取取样样,3737放放置置242472h,72h,无无细菌、霉菌污染方可使用细菌、霉菌污
5、染方可使用第5页/共27页注意事项注意事项 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，谷氨酰胺在溶液中很不稳定，分解，分解，放置两周以上时，根据需要添加谷氨，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制酰胺。配制母液（母液（200 mmol/L,200 mmol/L,即即29.22g/L29.22g/L）,每每100ml100ml加入加入0.50.52 ml2 ml母液，母液，终浓度终浓度1 14 mmol/L 4 mmol/L 抗生素在抗生素在3737稳定性维持稳定性维持3 34d,4d,可控制轻度可控制轻度污染。防污染重在无菌操作污染。防污染重在无菌操作 第6页/共27页 培养液配制过程培养液配制过程 （以
6、（以RPMI1640RPMI1640为例）为例）第7页/共27页1.1.物品准备物品准备(1(1）滤器、）滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、量筒、pHpH计、贮液瓶等。计、贮液瓶等。第8页/共27页(2)(2)培养粉、培养粉、NaHCONaHCO3 3、1N HCl1N HCl、青霉素、链、青霉素、链霉素、血清、霉素、血清、新鲜制备新鲜制备的三蒸水的三蒸水第9页/共27页 2.滤器消毒准备第10页/共27页取取孔径为0.45m0.45m和和0.22m0.22m滤膜各一张，浸入三蒸滤膜各一张，浸入三蒸水中水中 第11页/共27页将浸湿后的滤膜光面向上
7、依次置于滤器上将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上第12页/共27页将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒第13页/共27页 3.液体配制第14页/共27页 将培养粉倒入容器中将培养粉倒入容器中第15页/共27页加入加入新鲜制备的三蒸水新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器磁力搅拌器充分充分搅拌搅拌第16页/共27页按照实验的具体要求分别加入按照实验的具体要求分别加入 NaHCONaHCO3 3和青链霉素和青链霉素（青霉素（青霉素100U/mL100U/mL：8080万万U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水,取取0.5ml0.5ml；链霉素链霉素100U/mL100U/mL
8、：100100万万U U溶溶至至5ml5ml三蒸水三蒸水,取取0.5ml)0.5ml)第17页/共27页按按要要求求加加入入一一定定比比例例的的血血清清（血血清清一一般般需经需经5656，30min30min灭活）灭活）例例如如:配配制制含含10%10%胎胎牛牛血血清清的的RPMI1640RPMI1640培养液培养液1 1升，应加入升，应加入 无血清培养液无血清培养液900ml900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清100ml100ml第18页/共27页加入1N HCl1N HCl约3mL,3mL,调整pHpH至7.27.27.47.4第19页/共27页磁力搅拌器磁力搅拌器充分搅拌充分搅拌准备过滤准备过滤第20页/共27页 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。(一般使用氧气。一般使用氧气。注意气压适当注意气压适当,防止滤膜破裂，防止滤膜破裂，)第21页/共27页将将液液体体倒倒入入无无菌菌滤滤器器，接接通通气气体体第22页/共27页 过滤后的液体分过滤后的液体分装于贮液瓶装于贮液瓶第23页/共27页分装过程严格无菌操作分装过程严格无菌操作第24页/共27页分装后的液体贮存于分装后的液体贮存于44，2 2周内用完。周内用完。第25页/共27页第26页/共27页感谢您的观看！第27页/共27页