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1、关于细胞培养液的配制现在学习的是第1页，共27页 培养基的选择 依据依据:经验、文献、尝试经验、文献、尝试 常用常用:RPMI1640:RPMI1640、DMEMDMEM 培养基的来源 市售干粉培养基市售干粉培养基-自己配制自己配制 液体培养基液体培养基-直接使用直接使用(注意有效期注意有效期)现在学习的是第2页，共27页培养基的除菌方法 过滤除菌过滤除菌:(1):(1)正压过滤正压过滤-效率高效率高 (2)(2)负压过滤负压过滤-效率低效率低 高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌:不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加按使用说明或实验要求添
2、加 配制时加配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加临用前加:生物活性因子如生物活性因子如EGFEGF、FGFFGF、NGFNGF、PDGFPDGF等等 现在学习的是第3页，共27页RPMI1640培养液配制过程 准备物品 (1)(1)不锈钢过滤器不锈钢过滤器,滤膜滤膜(0.45m,0.22m),(0.45m,0.22m),磁力搅磁力搅拌器拌器,天平天平,烧杯烧杯,量筒量筒,盐水瓶盐水瓶 (2)(2)培养粉培养粉,1N HCl,NaHCO,1N HCl,NaHCO3 3,青霉素青霉素,链霉素链霉素,胎牛血胎牛血清清,新鲜三蒸水新鲜三蒸水 消毒物品 滤器中放置滤器中放
3、置0.45m0.45m和和0.22m0.22m滤膜滤膜,包装包装,高压蒸高压蒸气消毒气消毒现在学习的是第4页，共27页配制步骤(1)10.4g/(1)10.4g/包培养粉溶至包培养粉溶至1L1L三蒸水中三蒸水中,磁力搅拌磁力搅拌20min20min(2)(2)加加2g NaHCO2g NaHCO3 3/L,/L,继续搅拌继续搅拌10min10min(3)(3)加青霉素加青霉素100U/mL(80100U/mL(80万万U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水,取取0.5ml)0.5ml)链霉素链霉素100U/mL(100100U/mL(100万万U U溶至溶至5ml5ml三蒸水三蒸水,取取0.5
4、ml)0.5ml)(4)(4)加加1N HCl1N HCl约约3mL,3mL,调调pHpH至至7.2,7.2,继续搅拌继续搅拌现在学习的是第5页，共27页(5)(5)按要求加血清（血清一般需经按要求加血清（血清一般需经5656，30min30min灭灭活）活）例如例如:10%:10%胎牛血清胎牛血清 无血清培养液无血清培养液 900ml900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清 100ml100ml(6)(6)正压过滤除菌正压过滤除菌 (气压适当气压适当,防止滤膜破裂防止滤膜破裂)(7)(7)分装分装,贮存于贮存于44，2 2周内用完。周内用完。(8)(8)无菌试验无菌试验:取样取样,37,37放置
5、放置242472h,72h,无细菌、霉无细菌、霉菌污染方可使用菌污染方可使用现在学习的是第6页，共27页注意事项 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，谷氨酰胺在溶液中很不稳定，分解，分解，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制母液（母液（200 mmol/L,200 mmol/L,即即29.22g/L29.22g/L）,每每100ml100ml加入加入0.50.52 ml2 ml母液，终浓度母液，终浓度1 14 mmol/L 4 mmol/L 抗生素在抗生素在3737稳定性维持稳定性维持3 34d,4d,可控制轻度污染。可控制轻度污染。防污染重在无菌操作防污
6、染重在无菌操作 现在学习的是第7页，共27页 培养液配制过程 （以RPMI1640为例）现在学习的是第8页，共27页1.物品准备(1(1）滤器、）滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pHpH计、贮液瓶等。计、贮液瓶等。现在学习的是第9页，共27页(2)(2)培养粉、培养粉、NaHCONaHCO3 3、1N HCl1N HCl、青霉素、链霉素、青霉素、链霉素、血清、血清、新鲜制备的三蒸水新鲜制备的三蒸水现在学习的是第10页，共27页2.滤器消毒准备现在学习的是第11页，共27页取取孔径为0.45m0.45m和和0.22m0.22m滤膜各一张，浸入
7、三蒸水中滤膜各一张，浸入三蒸水中 现在学习的是第12页，共27页将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上现在学习的是第13页，共27页将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒现在学习的是第14页，共27页3.液体配制现在学习的是第15页，共27页 将培养粉倒入容器中将培养粉倒入容器中现在学习的是第16页，共27页加入加入新鲜制备的三蒸水新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器磁力搅拌器充分充分搅拌搅拌现在学习的是第17页，共27页按照实验的具体要求分别加入按照实验的具体要求分别加入 NaHCONaHCO3 3和青链霉素和青链霉素（青霉素（青霉素10
8、0U/mL100U/mL：8080万万U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水,取取0.5ml0.5ml；链霉素链霉素100U/mL100U/mL：100100万万U U溶溶至至5ml5ml三蒸水三蒸水,取取0.5ml)0.5ml)现在学习的是第18页，共27页按要求加入一定比例的血按要求加入一定比例的血清（血清一般需经清（血清一般需经5656，30min30min灭活）灭活）例如例如:配制含配制含10%10%胎牛血清的胎牛血清的RPMI1640RPMI1640培养液培养液1 1升，应升，应加入加入 无血清培养液无血清培养液900ml900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清100ml100ml现在学
9、习的是第19页，共27页加入1N HCl1N HCl约3mL,3mL,调整pHpH至7.27.27.47.4现在学习的是第20页，共27页磁力搅拌器磁力搅拌器充分搅充分搅拌拌准备过滤准备过滤现在学习的是第21页，共27页 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。(一一般使用氧气。注意气压适当般使用氧气。注意气压适当,防止滤膜破裂，防止滤膜破裂，)现在学习的是第22页，共27页将液体倒入无菌滤器，接通将液体倒入无菌滤器，接通气体气体现在学习的是第23页，共27页 过滤后的液体分装于过滤后的液体分装于贮液瓶贮液瓶现在学习的是第24页，共27页分装过程严格无菌操作分装过程严格无菌操作现在学习的是第25页，共27页分装后的液体贮存于分装后的液体贮存于44，2 2周内用完。周内用完。现在学习的是第26页，共27页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第27页，共27页