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1、一、一、IEFE IEFE 定义定义 IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。第1页/共55页 各种蛋白质各自都有一个等电点各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的在一特殊的pHpH环境中环境中,蛋白质分子呈蛋白质分子呈电中性电中性,在电场中不会迁移。在电场中不会迁移。等电聚焦等电聚焦就是在电泳介质中放入就是在电泳介质中放入载体两性电解质载体两性电解质，当通以直流电时，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pHpH梯度，在此体系中，不同梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上
2、，也就是说被聚焦于一个的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。第2页/共55页二、二、IEFEIEFE的的特点特点（一）优点1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位），灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。2.电泳区带相当狭窄。3.重复性好。第3页/共55页（二）缺点1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。第4页/共55页 分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高，更高，特别适
3、合于分离分子量相同而电荷特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。不同的生物大分子。第5页/共55页三、三、IEFE的基本原理的基本原理第6页/共55页蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI 第7页/共55页 在电泳介质中放入载体两性电在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加质形成一个由正极到负极逐渐增加的的pHpH梯度，正极附近是低梯度，正极附近是低pHpH区，负区，负极附近是高极附近是高pHpH区。区。第8页/共55页蛋白质
4、分子的电聚焦过程 +pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn-a b c a.蛋白质分子在负极端b.蛋白质分子在正极端c.蛋白质样品中各组分聚焦成区带 +第9页/共55页 在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。第10页/共55页进行进行IEFEIEFE必须具备必须具备3 3个条件：个条件：有有一一个个在在电电泳泳条条件件下下基基本本稳稳定定、重重复复性性良良好好的的pH梯度梯度有有一一个个抗抗对对流流的的电电泳泳材材料料，使使已已经经分
5、分离离的的样样品品不不再重新混合再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带第11页/共55页（一）pH梯度的建立 用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度第12页/共55页1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；在pI处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。第13页/共55页2.载体两性电解质的合成本质：一系列脂肪族多
6、氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。pH范围：pH310丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）加成反应第14页/共55页第15页/共55页第16页/共55页3.pH梯度的形成 载载体体两两性性电电解解质质是是一一系系列列不不同同分分子子的的两两性性电电解解质质的的混混合合物物,在在通通电电后后，它它们们各各自自迁迁移移到到适适当当位位置置形成一个连续的形成一个连续的pHpH梯度。梯度。第17页/共55页pH梯度形成的过程第18页/共55页没通电时的变化没通电时的变化 所所有有的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子都都荷荷电电，只只是是溶溶液液中中荷
7、荷正正电电和和荷荷负负电电的的基基团团数数目目相相等等，净电荷为零。净电荷为零。第19页/共55页引入电场时的变化引入电场时的变化 载载体体两两性性电电解解质质分分子子将将向向阴阴极极或或阳阳极极迁迁移移，带带有有最最低低等等电电点点的的分分子子（荷荷最最多多的的负负电电）将将最最快快地地向向阳阳极极迁迁移移。当当它它达达到到净净电电荷荷是是零零的位置时才停止。的位置时才停止。其其次次一一些些低低pIpI的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子（荷荷其其次次多多的的负负电电）也也将将向向阳阳极极移移动动，直直到到它的净电荷被减少到零才停止。它的净电荷被减少到零才停止。第20页/共55页第21页
8、/共55页电泳结束后的变化电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加所有的载体两性电解质分子以增加pIpI级级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个己的位置而给出一个pIpI梯度。梯度。第22页/共55页第23页/共55页第24页/共55页电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH-在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a）第25页/共55页pH+-a第2
9、6页/共55页 由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH，当环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正极移动。(图b)第27页/共55页pH+-bpH=pHA-第28页/共55页 当环境pI95%6.87 95%6.87HbA2 HbA2 2 22 2 2-3%7.38 2-3%7.38HbF HbF 2 22 2 2%6.98 2%6.98HbA3 6.87HbA3 6.87第48页/共55页HbAHbA 正常成人血中主要的正常成人血中主要的HbHb成分。成分。HbAHbA2 2 正常成人正常成人HbHb中的一个次要成分，当中的一个次要成分
10、，当 胎儿出生时，其浓度不到胎儿出生时，其浓度不到1%1%，以后，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2%2.2%至至2.6%2.6%左右，最高范围一般左右，最高范围一般 不超过不超过3.5%3.5%。第49页/共55页 HbF HbF 1866 1866年发现，是胎儿和初生儿的年发现，是胎儿和初生儿的HbHb的主要成分，足月的初生婴儿血中大的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有约有70-80%70-80%为为HbFHbF，其余为其余为HbAHbA。婴儿出生后不久，婴儿出生后不久，HbFHbF的浓度迅速减少，的浓度迅速减少，同时同时HbAHbA相应增多，绝大多数正常人于出生后相应增多，绝大多数正常人于出生后6 6个月至个月至2 2年后，年后，HbFHbF便降至成便降至成人的正常浓度，以后人的正常浓度，以后HbFHbF一直存在。一直存在。第50页/共55页器材器材电泳仪凝胶玻管三角烧杯10cm长针头第51页/共55页试剂试剂 分离胶缓冲液Acr-BisTEMED、APAmpholine电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）第52页/共55页操作操作1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果 第53页/共55页思考题思考题1.PAGE与IEFE有何区别？2.本实验的关键步骤是什么？第54页/共55页感谢您的观看！第55页/共55页