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1、等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳IsoelectricIsoelectric Focusing Focusing ElectrophoresisElectrophoresis，IEFEIEFE一、一、IEFE IEFE 定义定义 IEFE一一种种利利用用具具有有pH梯梯度度的的支支持持介介质质分分离离等等点点电电不不同同的的蛋蛋白白质的电泳技术。质的电泳技术。各种蛋白质各自都有一个等电点各种蛋白质各自都有一个等电点,在在一特殊的一特殊的pHpH环境中环境中,蛋白质分子呈电中性蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。在电场中不会迁移。等电聚焦等电聚焦就是在电泳介质中放入就是在电泳介质中放入载载体
2、两性电解质体两性电解质，当通以直流电时，两性，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的加的pHpH梯度，在此体系中，不同的蛋白梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。焦电泳。二、二、IEFEIEFE的的特点特点（一）优点（一）优点n1.分辨率高（精密度可达分辨率高（精密度可达0.01pH单位），单位），灵敏度高（最低检出量达灵敏度高（最低检出量达
3、0.1ng）。）。n2.电泳区带相当狭窄。电泳区带相当狭窄。n3.重复性好。重复性好。（二）缺点（二）缺点n1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。白质可能发生沉淀。n2.样品中的成分必须停留在其样品中的成分必须停留在其pI，不适用不适用 在在pI不溶或发生变性的蛋白质。不溶或发生变性的蛋白质。分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高，特更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。同的生物大分子。三、三、IEFE的基本原理的基本原理蛋白质分子在不同蛋白质分子在不同pH下的解离状态下的解离状态 NH3
4、+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI 在电泳介质中放入载体两性电解在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的形成一个由正极到负极逐渐增加的pHpH梯度，正极附近是低梯度，正极附近是低pHpH区，负极区，负极附近是高附近是高pHpH区。区。蛋白质分子的电聚焦过程蛋白质分子的电聚焦过程 +pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn-a b c a.蛋白质分子在负极端b.蛋白质分子在正极端c.蛋白质样品中各组分聚焦成区带 +在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进
5、入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。进行进行IEFEIEFE必须具备必须具备3 3个条件：个条件：有有一一个个在在电电泳泳条条件件下下基基本本稳稳定定、重重复性良好的复性良好的pH梯度梯度有有一一个个抗抗对对流流的的电电泳泳材材料料，使使已已经经分离的样品不再重新混合分离的样品不再重新混合电电泳泳后后有有适适当当的的方方法法来来鉴鉴定定分分离离的的区带区带（一）（一）pH梯度的建立梯度的建立 用用多多种种两两性性电电解解质质混混合合物物建建立立稳稳定定良好的良好的pH梯度梯度1.理想的载体
6、两性电解质理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；化学性质稳定；各各成成分分的的pI彼彼此此接接近近，并并在在其其pI值值附附近近有有良良好好的缓冲能力；的缓冲能力；在在pI处具有足够的电导，导电性均匀；处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；可溶性好；对对280nm的的紫紫外外光光没没有有或或仅仅有有很很低低的的吸吸光光度度，不干扰样品的测定。不干扰样品的测定。2.载体两性电解质的合成载体两性
7、电解质的合成本本质质：一一系系列列脂脂肪肪族族多多氨氨基基多多羧羧酸酸同同系系物物和和异异构构体体，具具有有很很多多既既不不相相同同又又十十分分接接近相互连接的近相互连接的pI值。值。pH范围：范围：pH310丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）加成反应3.pH梯度的形成梯度的形成 载载体体两两性性电电解解质质是是一一系系列列不不同同分分子子的的两两性性电电解解质质的的混混合合物物,在在通通电电后后，它它们们各各自自迁迁移移到到适适当当位位置置形形成成一个连续的一个连续的pHpH梯度。梯度。pH梯度形成的过程梯度形成的过程没通电时的变化没通电时的变化 所所有有的的载载体体两两性性电
8、电解解质质分分子子都都荷荷电电，只只是是溶溶液液中中荷荷正正电电和和荷荷负负电电的的基基团团数数目目相相等等，净净电电荷为零。荷为零。引入电场时的变化引入电场时的变化 载载体体两两性性电电解解质质分分子子将将向向阴阴极极或或阳阳极极迁迁移移，带带有有最最低低等等电电点点的的分分子子（荷荷最最多多的的负负电电）将将最最快快地地向向阳阳极极迁迁移移。当当它它达达到到净净电电荷荷是是零零的的位位置置时才停止。时才停止。其其次次一一些些低低pIpI的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子（荷荷其其次次多多的的负负电电）也也将将向向阳阳极极移移动动，直直到到它它的的净净电荷被减少到零才停止。电荷被减少到
9、零才停止。电泳结束后的变化电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加所有的载体两性电解质分子以增加pIpI级数级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个位置而给出一个pIpI梯度。梯度。电解槽中，通电后，正负两极都会发生电电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：极反应：正极端反应：正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH-在负极引起在负极引起pH值的升高，在正极值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶
10、液造成了性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近在电极附近pH的急剧变化。（图的急剧变化。（图a）pH+-a 由由于于载载体体两两性性电电解解质质是是一一系系列列不不同同分分子子的的两两性性电电解解质质的的混混合合物物所所组组成成的的，设设其其中中某某一一成成分分为为A，它它的的pI=pH，当当环环境境中中的的pHpH时时，它它带带负负电电荷荷，朝朝正正极极移动。移动。(图图b)pH+-bpH=pHA-当当环环境境pI95%6.87 95%6.87HbA2 HbA2 2 22 2 2-3%7.38 2-3%7.38HbF HbF 2 22 2 2%6.98 2%6.98HbA3 6.87H
11、bA3 6.87HbAHbA 正常成人血中主要的正常成人血中主要的HbHb成分。成分。HbAHbA2 2 正常成人正常成人HbHb中的一个次要成分，当中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到胎儿出生时，其浓度不到1%1%，以后，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2%2.2%至至2.6%2.6%左右，最高范围一般左右，最高范围一般 不超过不超过3.5%3.5%。HbF HbF 18661866年发现，是胎儿和初生儿的年发现，是胎儿和初生儿的HbHb的的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%70-80%为为HbFH
12、bF，其余为其余为HbAHbA。婴儿出生后婴儿出生后不久，不久，HbFHbF的浓度迅速减少，同时的浓度迅速减少，同时HbAHbA相相应增多，绝大多数正常人于出生后应增多，绝大多数正常人于出生后6 6个月个月至至2 2年后，年后，HbFHbF便降至成人的正常浓度，便降至成人的正常浓度，以后以后HbFHbF一直存在。一直存在。器材器材n电泳仪电泳仪n凝胶玻管凝胶玻管n三角烧杯三角烧杯n10cm长针头长针头试剂试剂 n分离胶缓冲液分离胶缓冲液nAcr-BisnTEMED、APnAmpholinen电极缓冲液（电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）操作操作1.凝胶的制备凝胶的制备 2.电泳电泳 3.剥胶剥胶 4.观察结果观察结果 思考题思考题1.PAGE与与IEFE有何区别？有何区别？2.本实验的关键步骤是什么？本实验的关键步骤是什么？