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1、成年小鼠海马组织中pp1的变化及其与低氧耐受的关系,病理学论文低氧预适应是指一般通过预先给予机体一个温和的( 亚致死性) 缺血/低氧刺激，能够加强机体对随后更严重的( 致死性) 缺血/低氧刺激的耐受力的现象。L 等1在上世纪六十年代发现小鼠经急性重复低氧暴露，能够使小鼠的低氧耐受时间增加。 利用急性重复低氧模型发现小鼠低氧耐受的极限约为 6% 氧气浓度，而低氧预适应小鼠的体温则降低到 25左右2。L 等提出有组织细胞机制介入低氧预适应的构成，能量代谢的变化则可能是低氧预适应构成的一个关键点3。通过基因表示出调控等使组织细胞从正常代谢状态转变为低代谢状态，这种变化机制可能是在极端条件下细胞面临生
2、死抉择时的基因表示出的变化。 蛋白磷酸酶( protein phosphatase，pp) 1 是脑内含量第二丰富的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，pp1 是真核细胞中高度保守的调节细胞能量使用的酶4，5。哺乳动物细胞中有三种 pp1 基因，它们分别编码pp1 ，pp1 ，和 pp1 / 。华而不实 pp1 表示出变化可能是调节细胞能量变化的最初的关键变化5。海马组织是大脑对低氧/缺血最为敏感的部位，本研究利用急性重复低氧小鼠模型，研究成年小鼠海马组织中pp1 的变化，并讨论其与低氧耐受构成的关系。 材料和方式方法 1 材料 18 22 g 雄性昆明小鼠( 6 8 周) 购于内蒙古大学实验动物中心。Tr
3、izol，superscript III 购自 In-vitrogen 公司; Qiagen DNA extraction kit 购自 Qiagen公司; EZ DNA Methylation kit 购自 ZYMO esearch公司; 2X eal-time PC Mix 购自 Bioner 公司; 兔源PP1 多克隆抗体购自 Santa Cruze 公司; 鼠源 -actin单克隆抗体购自 Sigma 公司; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗和驴抗鼠的二抗购自北京博奥森生物技术有限公司; BCA 试剂购自 Pierce 公司; pp1 活力试剂盒为 Genmed Scientifics
4、 国产试剂。 2 方式方法 2 1 低氧预适应小鼠模型的复制 雄性小鼠随机分为 H0、H1 和 H4 组，按我中心传统方式方法复制模型6-9，即 H0 组不进行低氧暴露( 空白对照组) ，H1组低氧暴露 1 次( 实验对照组) ，H4 组低氧暴露 4 次( 低氧预适应组) 。低氧结束断头取脑，剥离海马。 2 2 定量 PC ( eal-time PC) 用 Trizol 提取细胞总 NA，紫外分光光度计检测 NA 纯度和含量。根据逆转录反响试剂盒进行反转录 PC，得到 20 lcDNA 产物 20 保存。使用 ABI 公司的 96 孔板，每孔依次参加 cDNA 1 l，2 12 5 l，3 和
5、 5 端引物各 1 l，引物序列如下，无菌水 9 5 l，在 ABI7900 eal-time PC 反响仪上反响，每个样本设 3 个复空。反响参数: 94预变性3 min，再进行92，30s; 54 5 ，35 s; 72 ，30 s( 40 cycles) ，最后 72 延伸 5 min 停止反响。 PP1 F: GAGAACGAGATCCGAGGACTC， :CGTATTCAAACAGACGGAGCAA; -actin F: GGCT-GTATTCCCCTCCATCG， : CCAGTTGGTAACAAT-GCCATGT。 2 3 蛋白免疫印迹( Western Blot) 检测蛋白表示
6、出使用碧云天公司的 IAP buffer 裂解海马组织，用 BCA 试剂测定蛋白含量，加上样缓冲液调到各组蛋白量一致，10% SDS-PAGE，压缩胶20 mA，分离胶 30 mA，电泳结束后 400 mA 转移至 PVDF 膜，预染蛋白 marker 确定蛋白分子量标准位置。用含10% 脱脂奶粉 TTBS 液封闭，TTBS 洗 3 次，每次 10min; 参加 PP1 ( 1 500 ) 或 -actin ( 1 1000 ) 一抗，4 孵育过夜，TTBS 洗 3 次，每次 10 min; 1 10000 参加辣根过氧化物酶标记相应的二抗，37 孵育 1 h，TTBS 洗 3 次，每次 10
7、 min; 按 Pierce 公司的 ECL 试剂盒进行荧光显色反响。暗室中曝光，显影，定影。用分析软件 bandscan 分析每个条带的灰度值。 2 4 pp1 磷酸酶活性活力实验 根据国产试剂公司 Genmed Scientifics 生产的 pp1 活力检测试剂盒提供的方式方法提取蛋白并检测各组小鼠海马组织 pp1 磷酸酶活性活力。 2 5 pp1 启动子区( 95 bp 321 bp) DNA 甲基化测序( Bisulfite-modified DNA sequencing，BMDS) 利用 Qiagen DNA extraction kit 从小鼠海马组织提取基因组 DNA，根据 E
8、Z DNA Methylation kit 将基因组DNA 进行转换，转换后的 DNA 进行巢式 PC 扩增，外部引物为 5 -AGGGGTGATTTAGTGTTGAA-3 和5 -TCTCACTCGTCCTCCTTCCTCA-3 内部引物为5 -GTTAGATTTTTGTTTTTAAGTAGTAGAGT-3 ，和 5 -CTTCCTCCTCCTCTCGCCACT-3 。PC 产物纯化后连接入 PC2 1 载体中，转化 E Coli 后挑取 10 个阳性克隆送公司测序。 统计学处理: 结果以 x珋 s 表示，用 SPSS10 0 数据统计软件 ANOVA 和 Tukey 对组间数据进行处理和分
9、析，P 0 05 为差异有统计学意义。 结 果 1 低氧预适应小鼠海马组织 pp1 mNA 表示出的变化 pp1 mNA 相对丰度以 delta-delta CT 表示，华而不实以 -actin 为内参( Fig 1) 。pp1 1 mNA 相对丰度在 H0 组为 0 049 0 013，H1 组为 0 040 0 008，H4 组为 0 028 0 007，H4 组与 H0 组相比，差异有统计学意义( P 0 01，Fig 1) 。 2 低氧预适应小鼠海马组织 pp1 蛋白表示出的变化 pp1 蛋白丰度通过 Western Blot 来检测( Fig 2A) ，其相对丰度以目的蛋白丰度/be
10、ta-actin 蛋白丰度表示。pp1 蛋白相对丰度在 H0 组为 1 41 0 18，H1组为 1 32 0 19，H4 组为 1 09 0 11。H4 组 pp1 蛋白水平降低，与 H0 组相比，差异有统计学意义( P 0 05，Fig 2B) 。 3 低氧预适应小鼠海马组织 pp1 磷酸酶活性的变化 pp1 磷酸酶活性实验检测 H0 组、H1 组和 H4 组海马组织中 pp1 磷酸酶的活性，H0 组的活性为2 15 0 61，H1 组的活性为 1 16 0 15，H4 组的活性为1 12 0 16，H1 组和 H4 组分别与 H0 组相比，差异有统计学意义( P 0 05) ，讲明急性重
11、复低氧预适应使 pp1 磷酸酶的活性降低( Fig 3) 。 4 低氧预适应小鼠海马组织 pp1 启动子区( 95 321 bp) 甲基化的改变 利用 Methyl Primer Express v1 0 软件对 pp1 启动子区 416 bp 片段进行分析( 95 321 bp) ，发现该片段包含 49 个 CpG 点，该段 CpG 二核苷酸高于0 6符合 CpG 岛特征。利用 Bisulfite-Modified DNASequencing 研究发现 H0、H1 和 H4 三组 pp1 启动子区( 95 321 bp) 甲基化情况未见显着差异，而该段第12 位和38 位 CpG 都为半甲基
12、化状态( Fig 4) 。 讨 论 神经细胞的正常功能依靠于持续的氧和糖的供应以产生 ATP 去维持细胞内外的离子分布差异，低氧会由于 ATP 产生的缺乏而使神经细胞遭到损伤10。因而，缺血/低氧环境下细胞存活的关键是避免 ATP 的快速下降，而神经细胞能够通过改变基因表示出变化来改变其代谢策略使细胞在特殊环境下实现生存8。pp1 对于神经细胞能量代谢有重要作用5，pp1 转录起始点上游有一段 300 bp 的 GC 含量高达 79% 的区域，这段高 GC 区控制着 pp1 的转录11。我们先前研究显示低氧预适应降低海马脑区 DNMT3A 和 DNMT3B 的表示出12。本研究主要讨论 pp1
13、 在低氧预适应经过中作用及其变化与其DNA 甲基化的关系。 Taylor 等13研究显示低氧条件下 pp1 表示出降低，与 Taylor 等研究结果类似，我们的研究结果显示低氧预适应能够使 pp1 在 mNA 和蛋白水平表示出均降低。同时我们研究显示 pp1 的磷酸酶的活力降低，固然我们没有直接检测 pp1 磷酸酶的活力的变化，但从 pp1 活力的变化，我们能够揣测低氧预适应经过中 pp1 磷酸酶的活力可能降低。pp1 靶蛋白之一的环腺苷酸应答原件结合蛋白( CEB) 在神经细胞功能中有重要作用，CEB 的功能的变化是通过其丝氨酸( Ser-133) 磷酸化变化实现的5，而其丝氨酸的去磷酸化作
14、用是由 pp1 调节的，一些与代谢相关基因，如 Bcl-2 等通过 CEB 介入到低氧或氧化抑制条件下的神经保卫14，15。利用我们的急性低氧预适应小鼠模型发现小鼠海马 CEB 的磷酸化水平升高16，因而 pp1 的变化可能是预适应早期项( early phase) 构成的关键事件。 DNA 甲基化是真核细胞基因表示出调控的一种重要的方式，DNA 甲基化在神经系统中有重要作用，其在神经发育和分化，突触可塑性，学习记忆以及维持神经元的生存等相关基因的表示出方面具有重要作用17，催化 DNA 甲基化的酶为 DNA( 胞嘧啶-C5) 甲基转移酶18。我们先前研究报道低氧预适应经过中，DNA 甲基转移
15、酶 3A 和 3B 表示出降低12，同时 pp1 启动子区符合 CpG 岛特征11，因而我们对pp1 启动子区( 95 bp 321 bp) 进行了 BMDS 研究。 结果 显示低氧预适应没有改变其甲基化状态，因而我们揣测急性重复低氧在短时间内( 几个小时) 没有影响其启动子区( 95 bp 321 bp) 甲基化状态，其表示出变化可能是由其它因素引起的。通过急性重复低氧小鼠模型观察到低氧预适应能够使脑保卫基因表示出上调并使脑损伤基因表示出下调，上调的基因一般为低代谢/抑制凋亡的基因8。在能量代谢调节中有重要作用的 pp1 表示出的下调，正是通过低代谢来实现神经保卫的。固然 DNA 甲基化在基
16、因表示出调控中有重要作用，但本研究观察到 pp1 表示出变化不依靠于其动子区( 95 bp 321bp) 甲基化状态的改变，其表示出变化的原因有待于进一步研究。 参 考 文 献 1Lu GW Tissue-cell adaptation to hypoxia J Adv Pathophysiol，1963，1: 197 239 2Cheng F，Xie S，Guo M，et al Altered glucose metabolism andpreserved energy charge and neuronal structures in the brain ofmouse intermittently exposed to hypoxia J J Chem Neuroanat，2018，42: 65 71 3Lu GW，Yu S，Li H，et al Hypoxic preconditioning: a novel in-trinsic cytoprotective strategy J Mol Neurobiol，2005，31: 255 271