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1、研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理,植物保护论文石斛属Dendrobium spp.是兰科植物的第二大属，当下该属在全世界共发现 1100 多种，在我们国家有 76 个种和 2 个变种。华而不实，石斛属药用植物金钗石斛D. nobile Lindl是传统珍贵中药，被我们国家历版药典所收录，以其枯燥或新鲜的茎入药，具有滋阴清热、益胃生津之成效。由于近年来石斛属药用植物被过度挖掘，野生资源接近干涸，石斛属药用植物已被国家列为一级保卫植物名录。随着人们对石斛中药材需求量的逐步增加，当下药用石斛属植物人工栽培的面积不断扩大。然而，随之而来的各种病害不断出现，严重阻碍了人工栽培的进一步发展，并给种植户带
2、来了宏大的经济损失。有研究表示清楚，钟器腐霉曾在云南省导致大规模鼓槌石斛、球花石斛、线叶石斛茎部的腐烂。在以往的研究中，我们鉴定出金钗石斛软腐病的病原真菌为终极腐霉。为深切进入研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理，讨论其在导致金钗石斛软腐病病害经过中的机制，金钗石斛的根、茎和叶等部位发生的显微、超微构造变化以及病原菌在植物体内的分布和侵染情况，本研究采用水压片法以及扫描电镜观察法分别对接种终极腐霉病原菌前后金钗石斛苗的根、茎和叶的构造变化进行观察，为深切进入理解病原菌的侵染经过，揭示其形态学特征和侵染机制，以及为更好预防和控制此病害的发生发展提供重要的理论根据。1 材料与方式方法1.1 材料1.
3、1.1 植物材料金钗石斛组培苗为本实验室保存。1.1.2 主要仪器ZEISS Axio Imager A1 型光学显微镜购自德国蔡司公司；JSM-6510 LV 型扫描电子显微镜购自日本电子株式会社。1.2 方式方法1.2.1 病原菌终极腐霉对金钗石斛的致病性试验 将刚出瓶的生长一致的株高 4 6 cm 的新鲜金钗石斛组培苗预先栽种在装有灭菌的栗树皮基质的塑料花盆内，每个花盆栽种 3 株组培苗。病原菌为金钗石斛发病植株上分离得到的终极腐霉。采用孢子喷洒叶片的方式方法进行致病性试验，接种的病原菌为孢子悬浮液1 106个/ml，均匀地喷洒于金钗石斛幼苗的叶片上。对照组喷洒无菌水。致病组和对照组均设
4、 30 个重复。接种后置于 20 25 温室塑料膜保湿培养 48 h，然后揭去塑料膜，天天观察植株发病情况。1.2.2 常规水压片法进行光镜观察取 1 滴10% KOH 溶液滴加到载玻片上，然后取健康的和发病 48 h 的金钗石斛的叶片作为观察对象，徒手切片法切取尽量薄的叶片组织，浸入 KOH 溶液中装片，光学显微镜下观察、照相。1.2.3 扫描电镜样品的制备流程取健康的以及发病 48 h 的金钗石斛的根、茎、叶等部位，用于制作扫描电镜样品，样品的处理按文献8进行：2.5% 戊二醛室温下固定 4 6 h 后，以 PBSpH6.8，0.1 mol/L洗涤 3 次，每次 30 min；分别经30%
5、、50%、70%、80%、90% 以及 100% 丙酮梯度脱水，每个梯度 3 次，每次 30 min；再经纯醋酸异戊酯置换 3 次，每次 30 min；经 CO2临界点枯燥、粘样，再经过金离子喷溅，最后于扫描电子显微镜下观察、拍照。2 结果2.1 光学显微镜观察致病前后金钗石斛叶片显微构造的变化在光学显微镜下，正常的叶肉细胞细胞壁较厚，排列规则，叶绿体分布于细胞的周边图 1A，而发病的叶肉细胞壁变薄，细胞完好性遭到毁坏，叶绿体分散、零乱图 1B，C。终极腐霉病原菌在金钗石斛叶片内大量存在，菌丝生长旺盛，直径可达 11 m，菌丝体内充满泡囊图 1C 黑色箭头所示，且具有流动性，这与终极腐霉有关的
6、形态描绘叙述相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在叶肉细胞间或内部，卵孢子壁厚 2 3 m图 1B。2.2 扫描电子显微镜观察致病前后金钗石斛根、茎、叶构造变化。2.2.1 金钗石斛植株被病原菌侵染前后的根外表和横切面显微构造 由图 2 能够看出，未被病原菌侵染的金钗石斛植株根的外表构造保持完好图2A，根被细胞显示出典型的网状纤维样构造，皮层细胞构造较完好，其体积明显比根被细胞大，有较多颗粒样物质图 2B 上箭头，揣测为淀粉粒样的构造，根的中柱髓部图 2B 下箭头构造也较完好，细胞排列规则。被病原菌侵染的金钗石斛植株根的外表分布有大量的病原菌终极腐霉的菌丝图 2C 箭头，病原菌菌丝体穿过根被死亡细
7、胞外表的各种孔洞，在根部蔓延和穿行，交织成网状，进而深切进入根皮层细胞，毁坏皮层细胞的细胞壁而导致细胞的坏死图 2C，D，终极腐霉高密度分布是宿主植物发病的基础，同时讲明这种土传植物病害病原菌终极腐霉首先必须在基质中侵入根部组织进而侵染其他组织导致植株的发病和死亡，这为我们提供了终极腐霉侵染植株直观的显微根据。2.2.2 金钗石斛植株被病原菌侵染前后的茎外表显微构造 由图 3 能够看出，未被病原菌侵染的金钗石斛植株茎外表保持完好的构造，茎叶鞘部位细胞纵向分布，排列极其规则，散在分布有气孔样构造图 3A。金钗石斛植株遭到病原菌侵染后，终极腐霉菌丝大量在茎外表穿行图 3B 白色箭头)、纵横交织，使
8、该部位的构造完好性遭到严重毁坏，茎外表出现了大大小小的孔洞；金钗石斛茎外表的终极腐霉菌丝产生分支图 3B 黑色*后，通过机械穿透作用进入组织内部图 3B 白色*，后又穿行暴露于茎外表图 3B 黑色*；终极腐霉菌丝出现不规则膨大，构成附着胞，并牢牢地黏附在茎外表图 3B 黑色箭头)，并将继续侵染植株的深部组织。2.2.3 金钗石斛植株被病原菌侵染的叶反面和横切面显微构造 图 4A 显示未被病原菌侵染的金钗石斛植株叶部的完好构造，横切面能够看到完好的维管束构造。图 4B 显示很多终极腐霉菌丝末端膨大，纵横排列，构成类似吸盘的特殊构造图 4B黑色箭头，牢固地附着于叶反面，从多个角度和部位黏附、侵染叶
9、反面。图 4C 显示大量病原菌菌丝从气孔处争相侵入寄主体内。图 4D 显示终极腐霉菌丝在气孔处发生断裂后，可见很多泡囊构造，这是终极腐霉的典型特征之一。2.2.4 金钗石斛植株被病原菌终极腐霉侵染的叶外表形态构造 由图 5 能够看出，叶外表分布的病原菌菌丝体中间出现膨大构成典型的孢子囊构造图 5A 黑色箭头。图 5B 示藏精器黑色箭头和藏卵器白色箭头的构造，它们是终极腐霉病原菌的有性繁衍器官，核配以后构成卵孢子进而产生下一代病原菌菌丝体。图 5C 示菌丝侧生的孢子囊构造，此孢子囊构造也称为厚垣孢子，其具有抵抗恶劣或极端环境的能力。3 讨论病原菌终极腐霉是全球性的重要植物病原菌，可引起多种农作物
10、和经济作物的病害，给国家造成宏大的经济损失。终极腐霉侵染石斛属植物的现象越来越普遍，当下国内外对终极腐霉的致病机制报道较少，侵染寄主的详细经过尚不明确，给该病原菌导致的病害的防治带来了极大困难。以往的研究表示清楚，终极腐霉能够产生多种蛋白以及纤维素酶、同工酶等细胞壁降解酶，导致细胞壁的降解，进而引起胡萝卜空斑症的发生。本研究系统地研究了终极腐霉感染金钗石斛前后的形态学变化，由徒手切片以及扫描电镜观察揣测，终极腐霉主要通过表皮、气孔等构造进行机械穿透、构成附着胞以及类似吸盘等特殊形态构造并分泌降解酶毁坏金钗石斛细胞的细胞壁及其内部构造，并在细胞间延伸侵染，使根、茎、叶组织严重毁坏，进而蔓延发病。植物病原菌侵染寄主是一个极其复杂的经过，在今后的研究中，利用胶体金标记技术及荧光标记技术系统地进行终极腐霉对金钗石斛不同器官致病性的细胞化学研究，以及深切进入讨论终极腐霉与金钗石斛互相作用的分子机制，不仅有利于终极腐霉致病机制的揭示，同时为开发有效的真菌抑制剂提供重要的理论基础。