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1、CoCl2诱导神经细胞慢性缺氧损伤的机制与优点,神经生物学论文原标题：氯化钴诱导神经细胞缺氧损伤的机制及应用 内容摘要：Co Cl2是研究神经退行性疾病建立缺氧模型时常用的造模药物，Co Cl2引起缺氧与Co2 +置换细胞内的氧感受器类血红素蛋白及一些催化酶中的Fe2 +、HIF表示出增加、ROS蓄积等都密切相关。本文就Co Cl2诱导神经细胞缺氧的可能机制及应用作一综述。 本文关键词语：Co Cl2; 神经细胞； 缺氧模型； 机制； 应用 缺血性脑血管疾病因发病率高、致残率高，与心脏病、恶性肿瘤一起构成了人类的三大致死性疾病。缺血性脑血管病发生时，缺血会直接引起神经细胞的缺氧损伤，引起神经细
2、胞的凋亡、构造改变和功能减退，这与癫痫、阿尔茨海默症、帕金森等多种疾病密切相关。氯化钴Co Cl2 由于使用方便、理化性质稳定而成为诱导神经细胞慢性缺氧损伤的首选药物，本文将从Co Cl2诱导神经细胞缺氧损伤的机制及其应用方向和特点作一综述。 一、Co Cl2在诱导神经细胞缺氧损伤的机制 Co Cl2诱导神经细胞缺氧的机制复杂，多条途径共同作用，并有特异性蛋白的表示出、免疫炎症反响及基因的活化或抑制。华而不实主要包括Co2 +的作用、缺氧诱导因子-1hypoxia inducible fator 1,HIF-1 的作用和反响活性氧reactive oxygen species,ROS 的蓄积反
3、响三方面，下面将从此三方面展开阐述。 一Co2 +的作用 包括神经细胞在内的大多数细胞的氧感受器都是胞内的一种类血红素蛋白，根据其Fe2 +能否与O2结合而分为氧合和脱氧状态，缺氧时它通过转变为脱氧合状态来感受细胞缺氧，然后经信息传递引起缺氧相关基因的转录。当Co2 +作用于细胞后，一方面它能够直接取代类血红素中的Fe2 +,使类血红素不能和氧结合而保持脱氧状态，进而模拟缺氧1; 另一方面，Co2 +会置换催化基团上的Fe2 +,进而阻止脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶的活性，抑制HIF-1 的降解，HIF-1 聚集后引起缺氧损伤作用2.除此之外，Co2 +可以以作为亚铁螯合酶的底物，亚铁螯合酶是
4、将铁合成亚铁血红素的重要的介入酶，Co2 +作为底物介入合成后可使新生成的类血红素蛋白失去携氧活性3.因而，Co Cl2能够抑制类血红素蛋白合成和影响其功能而发挥诱导缺氧的作用。 二HIF的作用HIF-1在细胞缺氧损伤的调节经过中处于关键地位。1992年，Semenza等在缺氧诱导的细胞核粗提液中发现了HIF-1,它主要由异二聚体的形式存在，由 和 两个亚单位组成。华而不实HIF-1 在细胞内表示出水平相对恒定，在常氧下，HIF-1 半衰期小于5分钟且一直处于合成和分解的状态，在胞浆中几乎检测不到，而缺氧细胞内HIF-1 的水平迅速增高，并成为细胞接受缺氧刺激的感受器4. HIF-1在抗缺氧损
5、伤和缺氧损伤经过中都起了重要的作用，神经细胞在应用Co Cl2后HIF-1表示出增高5.HIF-1 在细胞内受脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶二者的调节，在O2和Fe2 +存在的条件下发生羟基化，继而可与细胞内的肿瘤抑制蛋白Von Hippel-Lindau tumor suppresso r protein,p VHL结合并降解。在Co Cl2的作用下Fe2 +被置换，使HIF-1 无法羟基化而在细胞内聚集。HIF-1 堆积后首先进入细胞核与HIF-1 异物二聚化构成HIF-1,HIF-1作为反式作用因子与核染色体的缺氧反响元件结合而激活多种目的基因的转录和翻译经过。到当前 为 止 已 发 现6
6、0多 种 基 因 的 调 控 与HIF -1有关6. 在长期或严重缺氧时，胞浆内大量HIF-1 会发生去磷酸化而导致细胞发生凋亡。这是由于： 一方面HIF-1 发生了共价修饰使HIF-1 与HIF-1 解聚，进一步减少了HIF-1与缺氧反响元件的连接7;共价修饰后的HIF-1 会增加与Hsp40 /70的结合能力，募集Hsp70并介导泛素-蛋白酶体途径，HIF-1 迅速降解，细胞抗缺氧能力下降。另一方面，HIF-1 与位于Nip3翻译起始密码子上游234bp处基因启动子结合，进而促进Nip3的表示出 Althaus等。2006 ,Nip3是Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白成员，Nip3表示出增加
7、可与抗凋亡蛋白Bcl-2 / Bcl-XL结合直接抑制它们的抗凋亡作用； 同时还能直接结合到细胞内线粒体膜通透性转运孔复合物mitochondrialpermeability transition pore,MPTP 上，使线粒体膜的通透性增加、线粒体肿胀而导致促进凋亡因子释放，进而导致细胞发生凋亡。再者，去磷酸化的HIF-1 能够稳定P53蛋白，可以使促红细胞生成素EPO、内皮素-1ET-1、胰岛素样生长因子-2IGF-2 和血管内皮生长因子VEGF 等一系列蛋白的表示出异常共同介导细胞的凋亡发生8. 三ROS的作用Liu等9通过检测缺氧的海马神经元的裂解液中超氧化物歧化酶SOD 活性和丙二
8、醛MDA 含量发现神经元缺氧后SOD活性持续下降，MDA含量逐步增加，而应用抗氧化损伤药物可通过下调ROS明显保卫神经元，讲明自由基的蓄积在大脑缺血损伤经过中起了重要作用。Wang等10通过Co Cl2诱导PC12细胞缺氧并检测其ROS的生成量及相关凋亡蛋白 包括Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-XL 的 表 达 及P38MAPK磷 酸 化 程 度 发 现Co Cl2诱导PC12细胞缺氧后可导致ROS增加，同时ROS可上调凋亡相关基因表示出及促使p38MAPK磷酸化程度增加进一步促进细胞的凋亡损伤。在正常生理情况下，自由基不断产生并不断去除，始终维持在一个正常的生理水平。ROS包
9、括羟自由基、过氧化氢、一氧化氮、过氧亚硝酸盐和O2 -等，与线粒体氧化磷酸化功能密切相关。ROS在细胞缺氧损伤经过中起着重要的作用，其诱导凋亡的机制复杂至今尚无定论。其可能的机制主要是ROS产生增加或是去除减少时导致其蓄积并可能与其引起胞浆内Ca2 +变化，P38激活丝裂原活化蛋白P38MAPK 以及激活Caspase系统引起线粒体通透性等改变等有关。 1.胞质内Ca2 +水平升高：ROS引起细胞内Ca2 +变化主要是通过促进细胞膜Ca2 +通道开放和阻止Ca2 +从胞浆进入内质网，使Ca2 +在胞质内大量蓄积。其诱导凋亡的机制是一方面Ca2 +作为第二信使激活钙离子依靠性蛋白激酶1calci
10、um-activatedneutral proteases1,Calpains1。Calpains1活化后进一步激活Caspase-12诱发了内质网途径凋亡通路；另一方面Ca2 +蓄积使其与钙调素的结合减少，导致钙/钙调 素 依 赖 性 激 酶calcium/camodulin-de-pendent protein kinase ，Ca MK 活性受抑制，Ca MK是一种多功能蛋白激酶，在神经组织细胞中含量较多，其活性受抑制后会出现细胞内钙离子的调节障碍，内质网应激会加重11.除此之外在细胞凋亡经过中NADPH氧化酶和线粒体产生大量了ROS,并诱导Ca2 +蓄积，可进一步激活c-Jun N端激
11、酶c-Jun N-terminal kinase,JNK 通路。 2. P38MAPK激活：P38MAPK是高度保守的丝氨酸/苏氨酸丝裂原激活蛋白激酶家族成员，其主要功能是将胞外的信号传递至胞内，调控着细胞的生长、分裂、分化、死亡，以及调节细胞间的功能同步等多数经过。当细胞内ROS增加后一方面可激活蛋白酪氨酸激酶PTK ,活化后的PTK可通过分子SH2 / SH3蛋白进一步活化Ras蛋白，Ras蛋白能够激 活P38MAPK; 另 一 方 面ROS可 直 接 激 活P38MAPK并迅速导致其磷酸化，蛋白质空间构象改变，进一步活化一系列底物如转录因子、蛋白激酶、胞浆和胞核蛋白等，引发炎症反响、细胞
12、分化、细胞周期停滞、凋亡、衰老、细胞因子产生以及RNA剪接调控等Sehieven等。 2005。 3.引起线粒体通透性改变：Brookes等12以为在氧化应激条件下，细胞ROS水平升高，超过机体去除能力，使线粒体膨大、通透性改变、孔道构成，细胞色素C从内膜脱落并流失到细胞质中，影响bcl-xl基因表示出进而激活caspase系统。通过细胞免疫荧光技术、激光共聚焦以及Western blot技术检测可发如今细胞ROS增加的情况下一方面使线粒体膜电位降低、线粒体内膜心磷脂过氧化； 另一方使细胞质Bax移位至线粒体外膜促使线粒体通透性转换孔MPTP 改变，大量的凋亡蛋白如内外膜间蛋白细胞色素Ccyt
13、ochrome C、凋亡诱导因子AIF 等释放进入细胞质激活下游的凋亡复合体，进而使DNA剪切、凋亡小体构成。 通过对线粒体内膜ATP敏感钾通道mitochon-drial ATP-sensitive potassium channels,mito KATP 和ROS之间关系的研究也发现 Xuan等。 2005 : 在ROS介导下PKC的疏基激活，同时PKC通过c AMP通路和mito KATP开放使MPTP开放程度增大，进一步使线粒体构造和功能改变，诱导细胞线粒体通路凋亡。Zhong等以为113,在神经细胞应用Co Cl2后HIF-1 与ROS协同作用，并抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin,m TOR 活性介导缺氧损伤。 二、Co Cl2建模特点以及优势 Co Cl2作用神经细胞后往往引起细胞的慢性乏氧，经上述机制可引起多种蛋白、基因表示出介入缺氧损伤经过。既往研究表示清楚，Co Cl2在体内和体外均可成功模拟脑组织或细胞缺氧损伤，且均具有独特优势，尤其在体外造模中应用较广泛。