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1、流动相改性剂全面覆盖尿液代谢物检测的有效策略,医学检验论文摘 要： 采用高效液相色谱飞行时间质谱 HPLC-QTOF-MS 对尿液进行代谢组学分析，在流动相中分别添加甲酸，甲酸铵，乙酸铵 3 种流动相改性剂来考察尿液中代谢物的覆盖范围、离子响应强度和分辨率。通过标准品和质控样品评价手段建立了适用于尿液代谢物分析的方式方法。在该方式方法基础上，在流动相中分别添加甲酸、甲酸铵、乙酸铵，正负离子形式下尿液中检测到的离子数分别为 1452,1197,714 和 636,593,947.正离子形式下，添加甲酸后的离子质荷比范围最广为m / z 340. 0488 125. 7661; 负离子形式没有明显
2、差异不同。在正、负离子形式下，在流动相中添加甲酸和乙酸铵，代谢物覆盖率最高，且离子响应强度和分辨率有所提高。方式方法已应用于复合农药和壬基酚暴露的尿液代谢组学研究以及可能生物标志物的挑选。 本文关键词语： 高效液相色谱串联相飞行时间质谱； 代谢组学； 尿液； 流动相； 改性剂； 优化。 代谢组学是了解机体内源性代谢物动态变化的重要平台，主要是针对各种代谢途径中内源性小分子化合物进行研究，进而挑选出有意义的生物标志物1.丰富有效的代谢物数据是成功辨别潜在生物标志物的先决条件。因而，增加样品中代谢物的覆盖率对于代谢组学发现生物标志物是尤为重要的2.尿液是代谢组学研究中经常使用的生物样本3.华而不实
3、的内源性小分子主要包括脂肪酸、氨基酸、糖类和有机酸等。它们的极性和化学构造差异不同很大，简单的分离方式方法缺乏以勾画出其完好的代谢轮廓4. 在诸多代谢组学分析技术中，HPLC-QTOF-MS由于其高通量、高分辨、软电离，及覆盖代谢物广的特点而被广泛使用5.最常用的三种是反相液相质谱 RPLC 、正相液相质谱 NPLC 和亲水液相质谱 HILIC6.在这些方式方法中，反相液相质谱是使用最为广泛的。常用的色谱柱为 C8和 C18柱7.常用的流动相包括水或甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等有机溶剂的混合物。最常用的改性剂包括甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等。在对尿液样品进行代谢组学研究时，在甲酸和乙酸的选择
4、中，很多文献报道中添加了甲酸，而不是乙酸8,9.因而本研究针对甲酸、甲酸铵和乙酸铵 3 种流动相改性剂进行比照。 然而，至今没有系统的研究对 RPLC 中流动相改性剂进行评价。近期，有研究对碱性改性剂对RPLC 分 析 尿 液 代 谢 物 的 影 响 进 行 了 评 估。0. 05% 氢氧化铵和 1 5 mmol / L 甲酸铵 pH 9. 3 8. 8 的混合物被以为是提高代谢组学研究中脂质覆盖率的首选10.然而，由于当前的 C18柱固定相在碱性条件下通常是不稳定的，经常导致分离要在低温下进行。所以在 RPLC 分析中使用酸或中性流动相可能是更具优势的。 本研究考察了 3 种在 RPLC 尿
5、液代谢组学中常用的流动相改性剂，进行了 3 种流动相的总离子流色谱峰个数和检测到的离子数评价，碎片离子的响应强度评价，离子的 MS / MS 分辨率分析。结果表示清楚，在正离子和负离子形式下分别使用甲酸和乙酸铵改性剂是实现尿液中代谢物更全面覆盖的有效策略。 1 实验部分。 1. 1 试剂。 乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵、乙酸铵 色谱纯 购自 Sigma-Aldrich 公司。标准品： 脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、胞苷、组氨酸、苏氨酸、犬尿烯酸、5 - 羟色胺、酪氨酸、马尿酸、氢化可的松、雌酮色氨酸、胆酸、亚油酸 15 种尿液中常见物质购自Sigma-Aldrich 公司 尿液常见化合物数据
6、查自HMDB 数据库 .超纯水由美国 Milli-Q 超纯水系统净化。 1. 2 生物样品制备。 实验前将尿液样本在室温下解冻，保持4 以12000r / min 高速离心 15 min 除去尿液中蛋白，用超纯水将尿液上清液稀释 4 倍避免浓度太高污染仪器，涡旋震荡 1 min,通过 0. 22 m 水系滤膜过滤，装样品瓶待测。 混标溶液的制备： 选择 1. 1 节中的在正负离子形式下均可出峰，并分布在不同保存时间段的 15个标准品，分别称取 15 种标准品各 5 mg,分别溶于 1 mL 甲醇或甲醇 - 水 1: 1,V/V ,分别配制成单标溶液，然后取各单标溶液 20 L 混合配制成混标溶
7、液，用于色谱质谱条件的考察。 质控样品 QC 的制备： 将 30 例处理后的尿液样本各取 100 L 涡旋震荡混合，取 1 mL 装样品瓶待测。上机检测时，以 5 个 QC 样品开场序列，然后每 5 个待测样品间穿插一个 QC 样品，再以 5个 QC 样品结束序列。 1. 3 色谱及质谱条件。 使用安捷伦 1200 系列高效液相色谱仪 美国Agilent technologies 公司 ,Waters XBridge C8色谱柱 5 m,150 2. 1 mm .流动相 A 为水相，流动相 B 为乙腈，流动相 C 为甲醇。流动相梯度洗脱程序： 0 2 min,90% A; 2 40 min,9
8、0% 5% A并保持 10 min; 50 51 min,5% 90% A 并保持10 min,回到初始流动相比例。40 50 min,30%B,其他时间 B 相比例为 0.流速 300 L / min; 柱温： 40； 进样量 10 L.比照不同流动相改性剂效果时，分别在水相中添加 0. 1%甲酸、10 mmol/L 甲酸铵、10 mmol/L 乙酸铵考察检测结果。 利用 QSTAR Elite 飞行时间质谱 美国 Sciex 公司 ,配有 ESI 源，采用正负离子扫描形式，雾化气GS1 为 0. 414 MPa,雾化气 GS2 为 0. 345 MPa,气帘气为 0.138 MPa,离子源
9、温度为 500，聚焦电压为265V / - 265V,去 簇 电 压 为 80 V / - 80 V.采 用Analyst QS 2. 0 美国 Sciex 公司 数据分析系统。 1. 4 LC-MS 数据处理。 将通过 HPLC-TOFMS 方式方法获得质谱数据导入MarkerView 1. 2. 1 Sciex 和 Peakview 4. 0. 2 Sciex 软 件 进 行 峰 个 数、离 子 数 分 析。SPSSStatistics 17. 0 SPSS Inc. 软件统计 HPLC-QTOF-MS 采集到的离子的质荷比范围。 2 结果与讨论。 2. 1 HPLC-QTOF-MS 分析
10、方式方法的考察与优化。 尿液作为体内代谢物排出的主要途径，广阔的覆盖了体内的代谢物，尤其是水溶性和极性大的代谢物含量丰富。质谱条件的选定需兼顾各种类型及性质的代谢物检测。在本研究中，选取 15 种不同种类的代谢物标准品，对 3 种类型的色谱柱进行优化选择，分别使用了 Agilent Eclipse XDB C8色谱柱、Agilent Eclipse XDB C18色谱柱、Waters XBridgeC8色 谱 柱，最 后 选 择 分 离 效 果 最 好 的 WatersXBridge C8色谱柱，能够在较高的流速下实现对内源性代谢物高响应强度的分析。色谱条件主要是针对不同梯度洗脱条件进行了比拟
11、，最终确定了正负离子检测形式下的洗脱条件。对 HPLC-QTOF-MS 的正、负离子检测形式，进行了主要测参数的考察与优化，最终确定的质谱参数。 优化后的检测结果如此图 1 所示，能够看出在该色谱条件下各标准品分离度较高，峰形良好； 并且根据极性大小，在不同保存时间段的分布也比拟平衡。将混标溶液连续进样 5 次，计算各色谱峰保存时间和提取离子色谱峰峰面积的 RSD 值。结果显示，峰面积的 RSD 值均小于13%,各标准品保存时间的 RSD 值均小于 3%,以上结果表示清楚，本方式方法具有较高的精致细密度。QC 样本检测的偏差均控制在2SD 范围内，这表示清楚方式方法精致细密度良好。优化后的分析条件将用于不同流动相改性剂对尿液整体代谢轮廓影响的研究中。