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1、心血管药物活性快速筛选方法心血管药物活性快速筛选方法郭秀丽郭秀丽新药药理研究室新药药理研究室药物活性筛选药物活性筛选抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤与缺血预适应药物筛再灌注损伤与缺血预适应药物筛选选抗心功能不全药物筛选抗心功能不全药物筛选讲授内容讲授内容抗高血压药物筛选抗高血压药物筛选影响微循环药物筛选影响微循环药物筛选抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选抗动脉粥样硬化药物筛选抗动脉粥样硬化药物筛选心肌电生理实验法心肌电生理实验法心血管细胞的培养及应用心血管细胞的培养及应用第一部分第一部分 心血管细胞培养与检测心血管细胞培养与检测 原代心肌细胞：原代心肌细胞：采用乳大鼠心肌组织块多次反复低浓度
2、胰酶消化方法，采用乳大鼠心肌组织块多次反复低浓度胰酶消化方法，可得到生长迅速、活性好、纯度高的心肌细胞。可得到生长迅速、活性好、纯度高的心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速采用差速贴壁贴壁1h,除去成纤维细胞，达到纯化的目的。除去成纤维细胞，达到纯化的目的。二者形态差异很大，很好鉴别二者形态差异很大，很好鉴别。方法：方法：心肌细胞培养及应用心肌细胞培养及应用心肌细胞形态：心肌细胞形态：心肌细胞培养心肌细胞培养刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下
3、为纤维状条索，细壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好倾向，细胞搏动效果较好。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。缺血损伤模型：缺血损伤模型：模拟临床缺血性心脏病的发病机制，减少能量及氧的供给，模拟临床缺血性心脏病的发病机制，减少能量及氧的供给，可产生心肌细胞的缺血样损伤。可
4、产生心肌细胞的缺血样损伤。方法：培养的心肌细胞，用不含葡萄糖的方法：培养的心肌细胞，用不含葡萄糖的Eagle培养液充入培养液充入高纯氮气，饱和高纯氮气，饱和15min，置换掉培养瓶中的正常培养基，再向，置换掉培养瓶中的正常培养基，再向瓶内充氮瓶内充氮30s，然后塞紧瓶塞。给药组及其它各组心肌细胞培，然后塞紧瓶塞。给药组及其它各组心肌细胞培养瓶置于孵箱静置培养养瓶置于孵箱静置培养6h，造成损伤。，造成损伤。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。
5、）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。感染性损伤：感染性损伤：用多种病毒或其他微生物感染心肌细胞，模拟心肌炎，用多种病毒或其他微生物感染心肌细胞，模拟心肌炎，形成细胞病理模型。形成细胞病理模型。中毒性损伤：中毒性损伤：生物毒素如白喉毒素，链球菌溶血素，副溶血弧菌毒素生物毒素如白喉毒素，链球菌溶血素，副溶血弧菌毒素等，均可造成培养心肌细胞的中毒性损伤。化学毒物如丝裂等，均可造成培养心肌细胞的中毒性损伤。化学毒物如丝裂霉素，阿霉素，烟碱，一氧化碳，氰化钠，造成中毒性损伤霉素，阿霉素，烟碱，一氧化碳，氰化钠，造成中毒性损伤.（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细
6、胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。免疫性损伤：免疫性损伤：特异性或交叉反应性抗体与结合了补体的心肌细胞表面特异性或交叉反应性抗体与结合了补体的心肌细胞表面抗原之间发生反应，可引起心肌细胞的免疫性损伤。用大鼠抗原之间发生反应，可引起心肌细胞的免疫性损伤。用大鼠心肌匀浆给家兔皮下注射，每周一次，共五次，经鼠心抗原心肌匀浆给家兔皮下注射，每周一次，共五次，经鼠心抗原诱导，在兔体内形成抗鼠心抗体，制备成诱导，在兔体内形成抗鼠心抗体，制备成-球蛋白，与补球蛋白，与补体加入培养瓶，使心肌细胞发生免疫性损伤。体加入培养瓶，使心肌细胞发生免疫性损伤。
7、心力衰竭：心力衰竭：在培养在培养2-3天的心肌细胞培养瓶中加入戊巴比妥钠，可天的心肌细胞培养瓶中加入戊巴比妥钠，可诱导搏动减慢，甚至停博。用强心剂有明显治疗作用。诱导搏动减慢，甚至停博。用强心剂有明显治疗作用。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。（3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。改变培养基中的离子浓度：改变培养基中的离子浓度：例如钠、钾、钙、镁等浓度，可使心肌
8、细胞搏动加快、例如钠、钾、钙、镁等浓度，可使心肌细胞搏动加快、减慢、节律失常、纤颤等。减慢、节律失常、纤颤等。药物诱发节律失常：药物诱发节律失常：心肌细胞培养瓶中加入哇巴因、乌头碱或地高辛等，可心肌细胞培养瓶中加入哇巴因、乌头碱或地高辛等，可诱发节律失常，细胞发生颤动、扑动或扭动。诱发节律失常，细胞发生颤动、扑动或扭动。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。（3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。）观察
9、药物对心肌细胞搏动节律的作用。（4）观察药物对受体的影响。）观察药物对受体的影响。利用放射配基受体结合法分离、提纯、鉴定受体，进行利用放射配基受体结合法分离、提纯、鉴定受体，进行直接研究，用以说明受体的实质及各类药物的作用机制。直接研究，用以说明受体的实质及各类药物的作用机制。亦可用拮抗效应证实药物对各类受体的作用，激动剂或亦可用拮抗效应证实药物对各类受体的作用，激动剂或拮抗剂。拮抗剂。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。（2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。）观察药物对不同心
10、肌细胞损伤模型的作用。（3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。（4）观察药物对受体的影响。）观察药物对受体的影响。（5）观察药物对离子通道的影响。）观察药物对离子通道的影响。利用膜片钳技术，采用单个心肌细胞观察药物对钠、钾、利用膜片钳技术，采用单个心肌细胞观察药物对钠、钾、钙等离子通道的作用研究，证实药物对离子通道的开放、关钙等离子通道的作用研究，证实药物对离子通道的开放、关闭的作用。闭的作用。心肌细胞培养在药理学研究中的应用心肌细胞培养在药理学研究中的应用 第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成
11、分，在各种病理生理平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成分，在各种病理生理或体外培养条件下，可迅速增殖、迁移、合成并分泌细胞或体外培养条件下，可迅速增殖、迁移、合成并分泌细胞基质，在血管性疾病的发生、发展中起着重要的作用。基质，在血管性疾病的发生、发展中起着重要的作用。培养方法：培养方法：较多，主要有分散细胞原代培养法，组织块培养法，微血管较多，主要有分散细胞原代培养法，组织块培养法，微血管平滑肌细胞培养，平滑肌细胞蜕变培养，复合培养等平滑肌细胞培养，平滑肌细胞蜕变培养，复合培养等血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养组织来源：组织来源：兔、大鼠、猪、牛、羊等血管，都可用。取材部位，胸主动兔、大鼠、猪
12、、牛、羊等血管，都可用。取材部位，胸主动脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管等。脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管等。第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 培养方法：培养方法：（1）分散细胞原代培养法）分散细胞原代培养法 超净台内，新鲜的动脉剥去血管表面的纤维、脂肪和多超净台内，新鲜的动脉剥去血管表面的纤维、脂肪和多余的血块。移入含酶消化液余的血块。移入含酶消化液(胶原酶、弹性酶胶原酶、弹性酶)中，中，37消消化化30min，剥去外膜及外层中膜并用，剥去外膜及外层中膜并用Hanks 液冲洗动脉条液冲洗动脉条内壁以除去内皮细胞，将动脉条移入另一含酶消化液中，内壁以
13、除去内皮细胞，将动脉条移入另一含酶消化液中，37消化消化23h，收集细胞悬液，计数，接种。，收集细胞悬液，计数，接种。2h后开始贴后开始贴壁，每壁，每23d更换培养液，更换培养液，12周出现致密细胞层，传代周出现致密细胞层，传代.血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 超净台内，清洗干净的血管置于含有培养液的平皿中，将超净台内，清洗干净的血管置于含有培养液的平皿中，将剥去外、内膜的动脉中层切成剥去外、内膜的动脉中层切成1mm3的组织小块，规则排的组织小块，规则排列于培养瓶中，倒置培养瓶，加入培养液，孵箱中培养列于培养瓶中，倒置培养
14、瓶，加入培养液，孵箱中培养5h，翻转培养瓶，使组织块浸于培养液中，静置培养。细胞，翻转培养瓶，使组织块浸于培养液中，静置培养。细胞自组织块边缘长出，自组织块边缘长出，23周可出现致密的细胞层。周可出现致密的细胞层。血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养 培养方法：培养方法：（2）组织块培养法）组织块培养法第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 培养方法：培养方法：（3）微血管平滑肌细胞培养法）微血管平滑肌细胞培养法 超净台内，取出大脑半球，剪碎并匀浆，过超净台内，取出大脑半球，剪碎并匀浆，过200目尼龙目尼龙网，得到大脑组织块，溶于酶消化液（弹性酶，胶原酶，网，得到大
15、脑组织块，溶于酶消化液（弹性酶，胶原酶，大豆胰酶抑制剂等）大豆胰酶抑制剂等）37水浴震荡培养水浴震荡培养60min，组织悬液，组织悬液用吸管吹打，离心，细胞团块悬浮于培养基，孵箱培养用吸管吹打，离心，细胞团块悬浮于培养基，孵箱培养1218h，吸去未贴壁细胞和细胞团块，形成致密层，可传，吸去未贴壁细胞和细胞团块，形成致密层，可传代培养。代培养。血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 培养方法：培养方法：（4）平滑肌细胞蜕变培养）平滑肌细胞蜕变培养 病毒的细胞毒作用引起平滑肌蜕变造成血管损伤，是血管病毒的细胞毒作用引起平滑肌蜕变造成血
16、管损伤，是血管性疾病的重要病理机制之一。性疾病的重要病理机制之一。传代平滑肌细胞，经传代平滑肌细胞，经SV40感染感染2h，感染的细胞用，感染的细胞用Hanks F12K培养液培养一周，以培养液培养一周，以1：3的比率用同样培养液传代培的比率用同样培养液传代培养三周左右，可见不规则生长的蜕变细胞，积聚在另一个细养三周左右，可见不规则生长的蜕变细胞，积聚在另一个细胞上，收集蜕变细胞，培养在胞上，收集蜕变细胞，培养在DMEM中，建立蜕变平滑肌细中，建立蜕变平滑肌细胞培养模型。胞培养模型。血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 平滑肌细
17、胞和内皮细胞的体位复合培养，在一定程度上模拟平滑肌细胞和内皮细胞的体位复合培养，在一定程度上模拟体内血管壁的结构，有助于阐明药物对血管壁的影响。体内血管壁的结构，有助于阐明药物对血管壁的影响。利用利用PET膜，调整内皮细胞数接种于膜的一面，当形成致膜，调整内皮细胞数接种于膜的一面，当形成致密单层后，加入平滑肌细胞至膜的另一面，建立复合培养模密单层后，加入平滑肌细胞至膜的另一面，建立复合培养模型，可用于观察药物对内皮细胞和平滑肌细胞生长和分化及型，可用于观察药物对内皮细胞和平滑肌细胞生长和分化及平滑肌细胞的迁移等的影响。平滑肌细胞的迁移等的影响。血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养培养方法：培养
18、方法：（5）复合培养）复合培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 形态：形态：原代和原代和5代以内的平滑肌细胞常呈针形，代以内的平滑肌细胞常呈针形，5代以上的平滑肌代以上的平滑肌细胞形状增大，呈典型的生长形式即细胞成梭形或长梭形，细胞形状增大，呈典型的生长形式即细胞成梭形或长梭形，平行生长，束状排列，亦可重叠生长达多层。平行生长，束状排列，亦可重叠生长达多层。血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 人脐静脉内皮细胞培养人脐静脉内皮细胞培养原代培养：采用酶液灌注消化法原代培养：采用酶液灌注消化法新生儿
19、脐带，用新生儿脐带，用PBS将管腔冲洗干净。一端用止血钳夹将管腔冲洗干净。一端用止血钳夹紧，一端用注射器注入胶原酶使脐静脉充盈。孵育紧，一端用注射器注入胶原酶使脐静脉充盈。孵育20min后，用小镊子按摩使内皮细胞脱落。收集消化液，后，用小镊子按摩使内皮细胞脱落。收集消化液，置于培养瓶中培养。置于培养瓶中培养。12h后更换培养液，约后更换培养液，约710d细胞细胞融合，呈铺路石样镶嵌式单层排列。融合，呈铺路石样镶嵌式单层排列。传代培养：排列成单层后，可传代传代培养：排列成单层后，可传代10代以上。代以上。血管内皮细胞培养血管内皮细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养
20、与检测 内皮细胞的鉴定内皮细胞的鉴定形态学：铺路石样镶嵌式单层排列形态学：铺路石样镶嵌式单层排列因子因子间接免疫荧光检测：内皮细胞的特异鉴定法。间接免疫荧光检测：内皮细胞的特异鉴定法。加入第加入第因子相关抗原诊断血清，因子相关抗原诊断血清，再加入异硫氰酸荧光素再加入异硫氰酸荧光素FITC标记标记的羊抗兔的羊抗兔IgG血清，在荧光显微镜血清，在荧光显微镜下见细胞核周呈黄绿色亮荧光环，下见细胞核周呈黄绿色亮荧光环，阳性反应。阳性反应。血管内皮细胞培养血管内皮细胞培养第一部分第一部分 几类心血管细胞培养与检测几类心血管细胞培养与检测 人牛或猪主动脉内皮细胞培养人牛或猪主动脉内皮细胞培养原代培养：内膜
21、消化刮取法原代培养：内膜消化刮取法在主动脉近心端剥去外膜，纵向剪开动脉。将动脉内膜面在主动脉近心端剥去外膜，纵向剪开动脉。将动脉内膜面朝下覆盖于酶液上消化，朝下覆盖于酶液上消化，37孵育孵育15min，终止消化后用，终止消化后用塑料小勺来回轻刮内膜数次，使内皮细胞脱落。收集后离塑料小勺来回轻刮内膜数次，使内皮细胞脱落。收集后离心细胞，制成细胞悬液置于培养液中培养，一周后细胞融心细胞，制成细胞悬液置于培养液中培养，一周后细胞融合，可传代。合，可传代。传代培养：传代培养：10代以上代以上血管内皮细胞培养血管内皮细胞培养阿霉素心肌细胞损伤保护模型；阿霉素心肌细胞损伤保护模型；心肌细胞活力测定；心肌细
22、胞活力测定；作用于内皮细胞释放作用于内皮细胞释放NO的药物筛选模型；的药物筛选模型；血管内皮细胞氧化损伤保护模型；血管内皮细胞氧化损伤保护模型；血管内皮细胞血管内皮细胞ox-LDL损伤保护模型；损伤保护模型；血管平滑肌细胞迁移率测定模型；血管平滑肌细胞迁移率测定模型；Ang诱导诱导VSMC增殖的抑制活性筛选模型增殖的抑制活性筛选模型心血管细胞的药物筛选模型心血管细胞的药物筛选模型一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法1.形态学方法：形态学方法：一是组织学方法；一是大体标本染色法。一是组织学方法；一是大体标本染色法。组织学切片：组织学切片：用光镜作组织学切片检测
23、心肌缺血和梗死范围，直接可靠；用光镜作组织学切片检测心肌缺血和梗死范围，直接可靠；但需要作一系列切片才能准确定量，费时费力。但需要作一系列切片才能准确定量，费时费力。大体标本染色法大体标本染色法：常用：常用染料：无色的氧化型染料硝基四氮唑蓝染料：无色的氧化型染料硝基四氮唑蓝(NBT)，在心肌脱氢，在心肌脱氢酶作用下，还原成还原型的蓝色酶作用下，还原成还原型的蓝色NBT，使活体心肌染色；心，使活体心肌染色；心肌梗塞后心肌脱氢酶活性丢失，故梗死心肌不被蓝染。肌梗塞后心肌脱氢酶活性丢失，故梗死心肌不被蓝染。第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选一、心肌缺血与梗死
24、范围测量指标与方法一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法2.酶学法：酶学法：肌酸激酶测定法肌酸激酶测定法肌酸激酶（肌酸激酶（CK）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，这些组织受损伤时细胞内这些组织受损伤时细胞内CK因释放而减少，血清中因释放而减少，血清中CK活活性增加。测定组织及血清中性增加。测定组织及血清中CK活性变化能反映组织损伤活性变化能反映组织损伤情况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。情况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。测定方法：测定方法：肌酸量测定法、紫外分光测肌酸量测定法、紫外分光测NADPH方法、定磷法等方法、定磷法等第二部分第二部分 抗心肌缺血
25、抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法2.酶学法：酶学法：乳酸脱氢酶测定法乳酸脱氢酶测定法乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH）也是存在于心肌和脑组织中的一种酶，）也是存在于心肌和脑组织中的一种酶，这些组织细胞膜受损时细胞内这些组织细胞膜受损时细胞内LDH释放，血清中释放，血清中LDH活性活性增加。测定组织及血清中增加。测定组织及血清中LDH活性变化能反映组织损伤情活性变化能反映组织损伤情况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。测定方法：测定方法：比色测定法，紫外分光光度计法等比色测定法
26、，紫外分光光度计法等第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选二、在体心肌梗死模型二、在体心肌梗死模型1.大鼠法：大鼠法：乌拉坦麻醉，连接呼吸机，在第四或第五肋间钝性分离肌乌拉坦麻醉，连接呼吸机，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，在心脏动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处层，打开胸腔，在心脏动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉，缝合胸壁。结扎左冠状动脉，缝合胸壁。急性试验即可观察药物的作用，如急性试验即可观察药物的作用，如ECG的变化，心律失的变化，心律失常发生率，梗死范围等常发生率，梗死范围等亚急性实验，注射青霉素和链霉素防止感染。亚急性实验，注射青
27、霉素和链霉素防止感染。方法简便易行，但结扎手术有不成功例，观察方法简便易行，但结扎手术有不成功例，观察ECG波形波形.第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选二、在体心肌梗死模型二、在体心肌梗死模型2.家兔法：家兔法：乌拉坦麻醉，沿胸骨左缘剪断乌拉坦麻醉，沿胸骨左缘剪断13根肋软骨，不破坏胸膜根肋软骨，不破坏胸膜可不连接呼吸机。打开胸腔，提起左心耳，在冠状动脉前可不连接呼吸机。打开胸腔，提起左心耳，在冠状动脉前降支根部穿线结扎。也可在该部位下降支根部穿线结扎。也可在该部位下0.5cm处再穿一线，处再穿一线，可扩大梗死面积，便于观察药物疗效。可扩大梗死面积，便
28、于观察药物疗效。观察指标：观察指标：ECG ST段异常抬高，病理性段异常抬高，病理性Q波的出现；波的出现；NBT染色；染色；CK或或LDH活性活性第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选二、在体心肌梗死模型二、在体心肌梗死模型3.狗实验法：狗实验法：杂种狗，戊巴比妥钠麻醉，气管插管行人工呼吸，沿胸骨杂种狗，戊巴比妥钠麻醉，气管插管行人工呼吸，沿胸骨左缘第四或第五肋间开胸，暴露心脏。分离冠状动脉前降左缘第四或第五肋间开胸，暴露心脏。分离冠状动脉前降支主干中下支主干中下1/3交界处，描记
29、好对照的心外膜心电图。结交界处，描记好对照的心外膜心电图。结扎分离处，造成急性心梗。观察药物疗效。扎分离处，造成急性心梗。观察药物疗效。观察指标：观察指标：ECG ST段异常抬高，病理性段异常抬高，病理性Q波的出现；波的出现；NBT染色；染色；CK或或LDH活性活性第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型改良改良Langendorff离体心脏灌流法：离体心脏灌流法：正常离体心脏在缺氧再给氧时，可加剧心肌组织缺血性损正常离体心脏在缺氧再给氧时，可加剧心肌组织缺血性损伤，与临床冠脉搭桥术、溶
30、栓术及冠脉痉挛等再灌注心肌伤，与临床冠脉搭桥术、溶栓术及冠脉痉挛等再灌注心肌损伤相似。可筛选防治再给氧损伤的有效药物。损伤相似。可筛选防治再给氧损伤的有效药物。心脏从体内取出后，将主动脉套入装置中的主动脉插管以心脏从体内取出后，将主动脉套入装置中的主动脉插管以线结扎固定。线结扎固定。2min内完成。通入含内完成。通入含95%O2和和5%CO2的的Krebs-Henseleit液灌流。在肺动脉起始部与右室圆锥部液灌流。在肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪一小口，以利冠脉回流液的排出。之间剪一小口，以利冠脉回流液的排出。第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选第二部
31、分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型改良改良Langendorff离体心脏灌流法：离体心脏灌流法：以带线的蛙心夹夹住心尖，与肌力换能器相连，记录心肌以带线的蛙心夹夹住心尖，与肌力换能器相连，记录心肌收缩幅度和张力。收缩幅度和张力。可进行多种缺氧损伤模型：可进行多种缺氧损伤模型：缺氧不同时间后再给氧（再灌注）；缺氧不同时间后再给氧（再灌注）；局部缺血再灌注损伤；局部缺血再灌注损伤；低灌缺血再灌注损伤；停灌缺血再灌注损伤；低灌缺血再灌注损伤；停灌缺血再灌注损伤；再灌注心律失常再灌注心律失常第二
32、部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型改良改良Langendorff离体心脏灌流法：离体心脏灌流法：测量指标：测量指标：冠脉流量：收集冠脉回流液冠脉流量：收集冠脉回流液心肌收缩功能和舒张功能：心肌收缩功能和舒张功能：LVP，LVEDP，dp/dtmax心电图心电图心肌匀浆心肌匀浆CPK、LDH、ATP、MDA、氧自由基等、氧自由基等光镜或电镜形态学观察光镜或电镜形态学观察第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选四、体外培养乳大鼠心肌细胞缺氧、再给氧损伤模
33、型四、体外培养乳大鼠心肌细胞缺氧、再给氧损伤模型心肌细胞缺糖缺氧损伤心肌细胞缺糖缺氧损伤心肌细胞缺氧心肌细胞缺氧/再给氧损伤再给氧损伤观测指标：观测指标：胎盘蓝染色法测定心肌细胞存活率胎盘蓝染色法测定心肌细胞存活率测定心肌细胞培养液中测定心肌细胞培养液中LDH（较（较CPK稳定）稳定）心肌细胞心肌细胞MDA含量含量心肌细胞自由基含量心肌细胞自由基含量心肌细胞膜流动性等心肌细胞膜流动性等第二部分第二部分 抗心肌缺血抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选再灌注损伤药物筛选引起实验性心律失常的方法很多引起实验性心律失常的方法很多,包括：包括：药物诱导心律失常；药物诱导心律失常；电刺激引起心律失常；电刺激引起
34、心律失常；结扎冠状动脉引起心律失常；结扎冠状动脉引起心律失常；利用体外心肌细胞和电生理技术研究抗心律失常药对心肌利用体外心肌细胞和电生理技术研究抗心律失常药对心肌细胞的分子机制等。细胞的分子机制等。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选造成的实验性心律失常类型造成的实验性心律失常类型,包括：包括：1.房性心律失常模型：房性心律失常模型：(1)心房局部应用心房局部应用Ach、乌头碱引起心房颤动；、乌头碱引起心房颤动；(2)电刺激心房引起心房颤动；电刺激心房引起心房颤动；2.室性心律失常模型室性心律失常模型(1)肾上腺素或氯仿肾
35、上腺素或氯仿-肾上腺素引起室性心律失常肾上腺素引起室性心律失常(2)强心苷引起室性心律失常强心苷引起室性心律失常(3)乌头碱引起室性心律失常乌头碱引起室性心律失常(4)氯化钡或氯化钙引起室性心律失常氯化钡或氯化钙引起室性心律失常(5)电刺激心室引起心室颤动电刺激心室引起心室颤动(6)冠状动脉两步结扎引起室性心律失常冠状动脉两步结扎引起室性心律失常 第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选造成的实验性心律失常类型造成的实验性心律失常类型,包括：包括：3.对心肌自律性、不应期、传导性、兴奋性影响的模型：对心肌自律性、不应期、传导性、兴奋性影响的模型：4.抗心律失常药对心肌电生理特性影
36、响的实验模型抗心律失常药对心肌电生理特性影响的实验模型 5.体外培养心肌细胞的模型体外培养心肌细胞的模型观察指标：观察指标：以心电图以心电图导联记录以观察心律失常的发生时间、发生导联记录以观察心律失常的发生时间、发生类型、持续时间等；类型、持续时间等；用药方法可用预防给药和治疗给药用药方法可用预防给药和治疗给药第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选常用实验性心律失常造模的动物：常用实验性心律失常造模的动物：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫等小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫等特点特点：大鼠、豚鼠、兔和猫的心室颤动有自发恢复的可能，大鼠、豚鼠、兔和猫的心室颤动有自发恢复的可能，狗的很难恢复
37、；狗的很难恢复；小鼠用氯仿致心室颤动初筛药物；小鼠用氯仿致心室颤动初筛药物；大鼠对强心苷不敏感，不宜用哇巴因诱发心律失常；大鼠对强心苷不敏感，不宜用哇巴因诱发心律失常；豚鼠、家兔还适于作离体心脏心律失常等模型。豚鼠、家兔还适于作离体心脏心律失常等模型。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型1.氯仿、氯仿氯仿、氯仿-肾上腺素或肾上腺素所致的心律失常肾上腺素或肾上腺素所致的心律失常大剂量肾上腺素提高心肌的自律性；大剂量肾上腺素提高心肌的自律性；氯仿与肾上腺素合用增加对心脏的毒性。氯仿与肾上腺素合用增加对心脏的毒性。（1）氯仿引起小鼠心
38、室颤动模型：吸入）氯仿引起小鼠心室颤动模型：吸入（2）氯仿）氯仿-肾上腺素引起心律失常模型：氯仿吸入，肾上腺素引起心律失常模型：氯仿吸入，Adr静注静注（3）肾上腺素致狗心律失常：实验前一天先给狗静注）肾上腺素致狗心律失常：实验前一天先给狗静注酒石酸锑钾，再静注肾上腺素更易引起心律失常。酒石酸锑钾，再静注肾上腺素更易引起心律失常。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型2.强心苷类诱发心律失常强心苷类诱发心律失常强心苷中毒可出现多种类型的心律失常。强心苷中毒可出现多种类型的心律失常。常用的强心苷：哇巴因，地高辛，西地兰等常用的强心苷
39、：哇巴因，地高辛，西地兰等（1）哇巴因诱发狗室性心律失常）哇巴因诱发狗室性心律失常（2）哇巴因诱发豚鼠心律失常）哇巴因诱发豚鼠心律失常（3）强心苷对离体心脏诱发心律失常：加在灌流液中，）强心苷对离体心脏诱发心律失常：加在灌流液中，可预防给药或治疗给药可预防给药或治疗给药第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型3.乌头碱诱发心律失常乌头碱诱发心律失常机制：激活了心肌细胞的钠通道，使钠通道开放，加速机制：激活了心肌细胞的钠通道，使钠通道开放，加速心肌细胞心肌细胞Na+内流内流,促使细胞膜去极化，加速自律性，诱促使细胞膜去极化，加速自律性
40、，诱发异位节律点，形成多源性异位节律，缩短心肌不应期，发异位节律点，形成多源性异位节律，缩短心肌不应期，导致心律失常。导致心律失常。对整体动物、开胸局部应用、离体灌流心脏均可诱导心对整体动物、开胸局部应用、离体灌流心脏均可诱导心律失常发生。律失常发生。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型4.氯化钡或氯化钙诱发心律失常氯化钡或氯化钙诱发心律失常机制：钙离子对心脏的直接作用，还与肾上腺素能神经机制：钙离子对心脏的直接作用，还与肾上腺素能神经对心脏的影响有关。预先破坏大鼠中枢与支配心脏的交对心脏的影响有关。预先破坏大鼠中枢与支配心脏的
41、交感神经有关部位，或给予神经节阻断剂，可部分对抗氯感神经有关部位，或给予神经节阻断剂，可部分对抗氯化钙诱发的心律失常。化钙诱发的心律失常。静脉注射给予氯化钡或氯化钙。静脉注射给予氯化钡或氯化钙。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型5.心房局部应用心房局部应用ACh诱发心房颤动法诱发心房颤动法机制：心房局部应用机制：心房局部应用Ach诱发心房颤动的原因可能是兴奋折诱发心房颤动的原因可能是兴奋折返的结果，是由于返的结果，是由于Ach对局部阻滞而影响正常传导通路，同对局部阻滞而影响正常传导通路，同时缩短心房不应期，降低收缩强度等作用。
42、时缩短心房不应期，降低收缩强度等作用。局麻开胸动物，用浸有局麻开胸动物，用浸有5%Ach小棉球置于窦房结区，观察小棉球置于窦房结区，观察心电变化，心电变化，1min后用无齿镊子轻捏心房引起心房颤动。后用无齿镊子轻捏心房引起心房颤动。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选一、药物诱发心律失常模型一、药物诱发心律失常模型6.脑室内给药诱发心律失常法脑室内给药诱发心律失常法某些药物如戊四唑、印防己毒素、洋地黄等注入脑室内可某些药物如戊四唑、印防己毒素、洋地黄等注入脑室内可诱发心律失常，所用剂量较小。诱发心律失常，所用剂量较小。机制：中枢性兴奋迷走和交感神经的结果。机制：中枢性兴奋迷走
43、和交感神经的结果。狗、大鼠均可，主要引起室性心律失常。狗、大鼠均可，主要引起室性心律失常。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选二、电刺激诱发心律失常模型二、电刺激诱发心律失常模型1.电刺激下丘脑诱发心律失常电刺激下丘脑诱发心律失常下丘脑是影响心跳节律的重要神经中枢之一，刺激下丘脑下丘脑是影响心跳节律的重要神经中枢之一，刺激下丘脑可诱发心律失常，神经和精神因素被认为是产生室性心律可诱发心律失常，神经和精神因素被认为是产生室性心律失常和突然死亡的一个因素。提示可通过调节神经系统功失常和突然死亡的一个因素。提示可通过调节神经系统功能来治疗心律失常。能来治疗心律失常。动物：家兔、猫等
44、动物：家兔、猫等第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选二、电刺激诱发心律失常模型二、电刺激诱发心律失常模型2.电刺激心脏诱发心律失常电刺激心脏诱发心律失常优点：适度电刺激完全是可逆性的，不损伤心肌，比其他优点：适度电刺激完全是可逆性的，不损伤心肌，比其他方法更接近自然的异位冲动。方法更接近自然的异位冲动。特点：按刺激电极所放位置的不同，可诱发房性或室性心特点：按刺激电极所放位置的不同，可诱发房性或室性心律失常。随刺激强度的不同可引起早搏、心动过速、扑动律失常。随刺激强度的不同可引起早搏、心动过速、扑动或纤颤。或纤颤。动物：狗、家兔、猫等动物：狗、家兔、猫等在体心脏或离体心脏组织
45、均可在体心脏或离体心脏组织均可第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选二、电刺激诱发心律失常模型二、电刺激诱发心律失常模型2.电刺激心脏诱发心律失常电刺激心脏诱发心律失常（1）诱发在位心房颤动法诱发在位心房颤动法：开胸暴露心脏，用细软带钩的：开胸暴露心脏，用细软带钩的电极钩入心房，另一端连接方波刺激器。用低强度高频率电极钩入心房，另一端连接方波刺激器。用低强度高频率直流电刺激，记录直流电刺激，记录导联心电图。导联心电图。（2）诱发在位心室颤动法诱发在位心室颤动法：开胸暴露心脏，将做电极用的：开胸暴露心脏，将做电极用的钢制小夹子正极连接于心尖部，负极连接于右心室部，将钢制小夹子正极
46、连接于心尖部，负极连接于右心室部，将电极的另一端接于方波示波器监视心律变化，记录电极的另一端接于方波示波器监视心律变化，记录导联导联心电图。心电图。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选二、电刺激诱发心律失常模型二、电刺激诱发心律失常模型2.电刺激心脏诱发心律失常电刺激心脏诱发心律失常（3）心导管电极诱颤法心导管电极诱颤法：电极放置类似心导管右心插管。：电极放置类似心导管右心插管。（4）狗缺血心脏程控电刺激致室性心律失常模型狗缺血心脏程控电刺激致室性心律失常模型：狗冠脉二期结扎并部分再灌注及吻合支缝扎法造成狗狗冠脉二期结扎并部分再灌注及吻合支缝扎法造成狗急性前壁心肌梗死，急性前
47、壁心肌梗死，58天，狗自发性心律失常消失后，用天，狗自发性心律失常消失后，用心室程控刺激可重复诱发出快速室性心律失常，发生机制心室程控刺激可重复诱发出快速室性心律失常，发生机制为折返的形成。为折返的形成。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选二、电刺激诱发心律失常模型二、电刺激诱发心律失常模型2.电刺激心脏诱发心律失常电刺激心脏诱发心律失常（5）心肌细胞迟后除极和触发心律失常药理模型心肌细胞迟后除极和触发心律失常药理模型 强心苷等药物可致细胞内钙离子过多而诱发强心苷等药物可致细胞内钙离子过多而诱发Na+短暂性内短暂性内流而引起迟后去极化甚至触发心律失常。流而引起迟后去极化甚至触
48、发心律失常。本法利用标准微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位，并本法利用标准微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位，并结合哇巴因或异丙肾上腺素等观察药物对迟后去极化及触结合哇巴因或异丙肾上腺素等观察药物对迟后去极化及触发性心律失常的影响。发性心律失常的影响。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型1.冠状动脉两步结扎法冠状动脉两步结扎法 冠状动脉结扎造成心肌缺血梗死诱发心律失常是由于传冠状动脉结扎造成心肌缺血梗死诱发心律失常是由于传导障碍而产生单向传导阻滞和兴奋折返的结果，与临床急导障碍而产生单向传导阻滞和兴奋折返的结果，与临
49、床急性心肌梗死病人产生心律失常极为相似。多用狗性心肌梗死病人产生心律失常极为相似。多用狗 一次结扎动物死亡率较高，多死于早期室性颤动。采取一次结扎动物死亡率较高，多死于早期室性颤动。采取两步结扎法可避免。两步结扎法可避免。先打松结，插入针头后结扎第一结，抽出针头，先打松结，插入针头后结扎第一结，抽出针头，30min后再扎紧第二结。后再扎紧第二结。第三部分第三部分 抗心律失常药物筛选抗心律失常药物筛选三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型2.麻醉大鼠冠状动脉结扎诱发心律失常麻醉大鼠冠状动脉结扎诱发心律失常 用细小弯针在冠状动脉左前降支下穿一丝线，打一虚结用细小弯针在冠状
50、动脉左前降支下穿一丝线，打一虚结将心脏放入胸腔。此时大鼠会发生短暂心律失常和血压降将心脏放入胸腔。此时大鼠会发生短暂心律失常和血压降低。稳定低。稳定15min后，再结扎冠状动脉。此时出现血压明显下后，再结扎冠状动脉。此时出现血压明显下降，心率变化不大。约在结扎后降，心率变化不大。约在结扎后5min动物出现明显的室性动物出现明显的室性异位心律，有异位心律，有VP、VT、VF等。等。30min时最明显。时最明显。动物小易得，操作较狗简单，常作为抗心律失常药物筛动物小易得，操作较狗简单，常作为抗心律失常药物筛选的有效方法。还可观察药物对冠状动脉结扎后心肌梗死选的有效方法。还可观察药物对冠状动脉结扎后