《琼脂糖凝胶电泳5.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《琼脂糖凝胶电泳5.pptx（14页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、一、实验目的一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与电荷效应与分子筛效应分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理二、实验原理琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。第1页/共14页琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参
2、照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：注意事项：EBEB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，第2页/共14页三、实验材料、器具及药品 以前实验中提取的小麦总DNA和质粒样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），
3、10X载样缓冲液 四、实验步骤四、实验步骤 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。第3页/共14页 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。用移液器吸取1l的10X载样缓冲液于封口膜上,再加入4l 1TAE电泳缓冲液，最后加入总DNA或质粒样品2l，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-40min。第4页/共14页
4、 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。第5页/共14页植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA应呈现二或三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。第6页/共14页（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。琼脂糖电泳的优点第7页/共14页v配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 第8页/共14页常用的电泳缓冲液4 保存备用.第9页/共14页 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液常用的10X10X载样缓冲液第10页/共14页第11页/共14页第12页/共14页第13页/共14页感谢您的观看！第14页/共14页