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1、（优选）实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法细菌细菌 个体个体微小微小半透半透明明 未未染色染色细菌细菌大致大致形态形态大小大小单染色法单染色法复染色法复染色法能看清形态大小能看清形态大小但是无鉴别意义但是无鉴别意义能看清形态大小能看清形态大小又有鉴别意义又有鉴别意义显微镜显微镜细菌的染色细菌的染色（一）实验目的：（一）实验目的：1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。2、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。革兰氏染色法革兰氏染色法：是是18841884年由丹麦病理学家所创立的。革年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏
2、染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G G+）和和革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌（G G）两大类，该染色法所以能将细菌分为两大类，该染色法所以能将细菌分为G G+菌和菌和G G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。决定的。（二）实验原理（二）实验原理革兰氏染色原理革兰氏染色原理革兰阳性菌细胞壁的化学组成革兰阳性菌细胞壁的化学组成肽聚糖（肽聚糖（15-50层）层）细胞膜（双层脂质细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶）蛋白嵌镶）脂质脂质蛋白质蛋白质-1,4-1,4糖苷键糖苷键N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁
3、酸乙酰胞壁酸四肽链四肽链五肽桥五肽桥革兰阴性菌细胞壁的化学组成革兰阴性菌细胞壁的化学组成外膜外膜肽聚糖（肽聚糖（1-3层）层）细胞膜细胞膜脂质脂质蛋白质蛋白质脂质双层脂质双层脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖G G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，高，网格结构紧密，含脂量低，高，网格结构紧密，含脂量低，高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁当被酒精脱色时，引起了细胞壁当被酒精脱色时，引起了细胞壁当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以肽聚糖层网状结构的孔径缩小以肽聚糖层网
4、状结构的孔径缩小以肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶至关闭，从而阻止了不溶性结晶至关闭，从而阻止了不溶性结晶至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫紫紫紫-碘复合物的逸出，还是原来的碘复合物的逸出，还是原来的碘复合物的逸出，还是原来的碘复合物的逸出，还是原来的颜色。颜色。颜色。颜色。G G 肽聚糖层较薄，交联度低，肽聚糖层较薄，交联度低，肽聚糖层较薄，交联度低，肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，含较多类脂质，故用乙醇处理后，含较多类脂质，故用乙醇处理后，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，类脂质被溶解，细胞壁
5、孔径变大，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和通透性增加，使初染的结晶紫和通透性增加，使初染的结晶紫和通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱碘的复合物易于渗出，细胞被脱碘的复合物易于渗出，细胞被脱碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。色，经沙黄复染呈红色。色，经沙黄复染呈红色。色，经沙黄复染呈红色。结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染碘液媒染碘液媒染碘液媒染碘液媒染乙醇脱色乙醇脱色乙醇脱色乙醇脱色番红复染番红复染番红复染番红复染涂片固定涂片固定涂片固定涂片固定（二）实验原理（二）实验原理革兰氏染色原理革兰氏染色原理 芽孢（内生孢子）及其研
6、究芽孢的重要性芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性芽芽孢孢是是某某些些G G+菌菌形形成成的的圆圆形形或或椭椭圆圆形形的的休休眠眠体体，抗抗热热性性和折光性较强。和折光性较强。芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。（二）实验原理（二）实验原理芽孢染色法原理芽孢染色法原理中央芽孢中央芽孢偏端芽孢偏端芽孢游离芽孢游离芽孢末端芽孢末端芽孢（二）实验原理（二）实验原理芽孢染色法原理芽孢染色法原理芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染
7、料可进入菌体和芽孢；色时，染料可进入菌体和芽孢；进入菌体的染料经水洗后可被脱色；进入菌体的染料经水洗后可被脱色；当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。颜色（红色）。1、活材料：、活材料：革兰氏染色：培养革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养和培养24h大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）芽孢染色：培养芽孢染色：培养28-36 小时小时 的蜡状芽孢杆菌（的蜡状芽孢杆菌（B
8、acillus thuringiensis）2、染色液和试剂：染色液和试剂：革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃酒精、蕃红；红；芽孢染色液：芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液蕃红水溶液；二甲苯、香柏油二甲苯、香柏油。3、器材：器材：载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。（三）实验器材（三）实验器材 1.1.细菌涂片标本的制作细菌涂片标本的制作（1）涂片）涂片 载玻片载玻片1张，加张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。滴生理盐水，取菌研磨均匀。（2）干燥）干燥
9、室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。（3）固定）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。次。（四）实验步骤（四）实验步骤革兰氏染色革兰氏染色 2.2.革兰法染色革兰法染色（1 1）初染）初染 结结 晶晶 紫紫 2min 2min 细水冲洗细水冲洗 甩去积水甩去积水（2 2）媒染）媒染 卢戈碘液卢戈碘液 1min 1min 细水冲洗细水冲洗 甩去积水甩去积水（3 3）脱色）脱色 95%95%乙醇乙醇 20-30s 20-30s 细水冲洗细水冲洗 甩去积水甩去积水（4 4）复染）复染 番红番红 3min 3min 细水冲洗细水冲洗
10、 甩去积水甩去积水（四）实验步骤（四）实验步骤革兰氏染色革兰氏染色3.3.观察实验结果观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜下检查。镜下检查。革兰阳性菌（革兰阳性菌（G G+），），被染成被染成蓝紫蓝紫色。色。革兰阴性菌（革兰阴性菌（G G-），），被染成被染成红红色色。（四）实验步骤（四）实验步骤革兰氏染色革兰氏染色实验程序实验程序（革兰氏染色的方法和步骤）（革兰氏染色的方法和步骤）涂片涂片蒸蒸馏馏水水涂涂片片结结晶晶紫紫 碘碘 液液95%乙醇乙醇自然干燥自然干燥媒染媒染1min脱色脱色2030s初染初染1min、后水后水洗洗固定固定 番番红红复
11、染复染2min干燥干燥镜检镜检水洗时不要直接冲菌膜水洗时不要直接冲菌膜水洗水洗水洗水洗水洗水洗每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。2分钟分钟1分钟分钟3分钟分钟干干燥燥固固定定 取一干净载玻片取一干净载玻片在两端各加一滴生理盐水在两端各加一滴生理盐水无无菌操作取菌种菌操作取菌种涂于生理盐水中（涂于生理盐水中（成菌膜成菌膜）自然干燥自然干燥火焰固定火焰固定初染初染（结晶紫，结晶紫，2min2min）水洗水洗媒染媒染（碘液，碘液，1min1min）水洗水洗脱脱色色（乙醇，乙醇，20-30s20-30s）水洗水洗复染复染
12、（蕃红，蕃红，3min3min）水洗水洗自然干燥自然干燥观察。观察。（四）实验步骤（四）实验步骤革兰氏染色革兰氏染色涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄；膜宜薄；酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，要求脱至流出的乙醇不要求脱至流出的乙醇不带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去染色过程中勿使染色液干
13、涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。革兰氏染色注意事项革兰氏染色注意事项v制备菌悬液制备菌悬液v染色染色v涂片固定涂片固定v脱色脱色v复染复染v镜检镜检改良的改良的Schaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法（四）实验步骤（四）实验步骤芽孢染色芽孢染色芽孢染色芽孢染色-制备菌悬液制备菌悬液生理盐水生理盐水 1、滴生理盐水、滴生理盐水 挑取挑取2-3环菌苔环菌苔与生理盐水混匀与生理盐水混匀2、制备菌悬液、制备菌悬液在在EP管中滴管中滴2滴生理盐水滴生理盐水芽孢染色芽孢染色-
14、染色染色5%孔雀绿染液孔雀绿染液1、滴加孔雀绿染液、滴加孔雀绿染液沸水浴加热沸水浴加热15-20min2、加热染色、加热染色在离心管中滴在离心管中滴2-3滴孔雀绿染液滴孔雀绿染液芽孢染色芽孢染色-涂片固定涂片固定经孔雀绿染经孔雀绿染色细菌悬液色细菌悬液1、滴菌悬液、滴菌悬液用接种环用接种环均匀涂布均匀涂布2、涂片、涂片接种环取菌悬液接种环取菌悬液在载玻片中央在载玻片中央 3、干燥、干燥室温自然晾干室温自然晾干4、固定、固定通过酒精灯通过酒精灯火焰火焰3次固定次固定芽孢染色芽孢染色-复复 染染0.5%番红水溶液番红水溶液1、滴番红水溶液、滴番红水溶液滴加数滴番红染滴加数滴番红染液在菌膜上，染液在
15、菌膜上，染色色2min2、水洗、水洗不要直接冲菌膜不要直接冲菌膜蜡状芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌（B.cerB.cer）1 1 1 1、制备菌液：加、制备菌液：加、制备菌液：加、制备菌液：加2 2 2 2滴蒸馏水于滴蒸馏水于滴蒸馏水于滴蒸馏水于1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml离心管中，用接种环从斜面挑离心管中，用接种环从斜面挑离心管中，用接种环从斜面挑离心管中，用接种环从斜面挑取菌体取菌体取菌体取菌体2-32-32-32-3环于离心管中充分混匀。（环于离心管中充分混匀。（环于离心管中充分混匀。（环于离心管中充分混匀。（2 2 2 2人一组）人一组）人一组）人一组）2 2 2 2、染色：加孔雀
16、绿、染色：加孔雀绿、染色：加孔雀绿、染色：加孔雀绿2-32-32-32-3滴于小试管中。滴于小试管中。滴于小试管中。滴于小试管中。3 3 3 3、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，15-2015-2015-2015-20分钟。分钟。分钟。分钟。4 4 4 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。成涂片。成涂片。成涂片。5 5 5 5、干燥、火焰固定、干燥、火焰固定、干燥、火焰
17、固定、干燥、火焰固定6 6 6 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。7 7 7 7、复染：加、复染：加、复染：加、复染：加番红水溶液番红水溶液染色染色染色染色2-32-32-32-3分钟，水洗，吸水纸吸干。分钟，水洗，吸水纸吸干。分钟，水洗，吸水纸吸干。分钟，水洗，吸水纸吸干。、镜检：、镜检：、镜检：、镜检：10 x 10 x 10 x 10 x，40 x 40 x 40 x 40 x、100X100X100X100X（油镜）观察。绘图油镜）观察。绘图油镜）观察。绘图油镜）观察
18、。绘图（四）实验步骤（四）实验步骤芽孢染色芽孢染色1.1.分别绘出分别绘出枯草杆菌枯草杆菌和和大肠杆菌大肠杆菌的形态图，并注明两菌的的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的结果。革兰氏染色的结果。用红蓝笔画出模式图。用红蓝笔画出模式图。2.2.绘出芽孢的形状和着生位置，并注明染色结果（菌体颜绘出芽孢的形状和着生位置，并注明染色结果（菌体颜色和芽孢颜色）。色和芽孢颜色）。（五）实验作业（五）实验作业思考题：思考题：l你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？其中最关键的环节是什么？l你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。你的
19、染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。本次实验课结束本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！请确保油镜头擦拭干净！擦油镜镜头方法：擦油镜镜头方法：擦油镜镜头方法：擦油镜镜头方法：A A A A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B B B B）用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头；用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头；用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头；用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头；C C C C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯。