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1、实验三 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望（一）实验目的：（一）实验目的：n1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。n2、巩固显微镜油镜的使用技术。（二）实验原理：（二）实验原理：n1、革兰氏染色原理：n革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。n该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的
2、细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。2、芽胞染色法原理芽胞染色法原理：n细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色
3、法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。（三）实验器材（三）实验器材n1、活材料：n革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli）n芽孢染色：培养36 小时 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）n2、染色液和试剂：n革兰氏染色染色液：结
4、晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红；n芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液；n二甲苯、香柏油。n3、器材：n载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。（四）实验步骤（四）实验步骤n1、革兰氏染色：n（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。n（2）干燥：与简单染色法相同n（3）固定，与简单染色法相同n（4）初染：加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染色液染色1-2分钟n（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗n（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1minn（7）水洗：用水洗去碘液。n（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。n（9）复染：滴加蕃红复染2
5、min。n（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。n（11）干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。n（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。2、Schaeffer与Fulton氏芽孢染色法n（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。n（2）干燥：与简单染色法相同n（3）固定，与简单染色法相同n（4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后用木夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。n（5）水洗：待玻片冷却后
6、，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。n（6）复染：用蕃红液染色2min。n（7）水洗：n（8）干燥：n（9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。n结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。3、芽孢染色（1）制备菌悬液，1-2滴(2)染色，2-3滴孔雀石绿，沸水15-20min(3)涂片，自然干燥，火焰固定(4)脱色（水洗）：轻轻冲洗，自然干燥(5)复染，番红2-3min(6)水洗(7)镜检n（10）实验完毕后的处理：n将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一
7、个方向擦拭。n看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。（五）实验报告（五）实验报告n1、给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。n2.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？n3.绘图说明你所观察的枯草芽孢杆菌菌体形态，芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。n4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？（六）注意事项（六）注意事项n1、革兰氏染色革兰氏染色注意事项注意事项n（1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。n（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。n（3）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。2、芽孢染色注意事项芽孢染色注意事项n（1）供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。n（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。