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1、目次前言21.范围32.规范性引用文件33.术语和定义34.原理45.测试系统46.仪器与试剂耗材47.试验方法51化妆品体外皮肤致敏试验-ARE-Nrf2荧光素酶试验方法1范围本标准规定了体外皮肤致敏试验：ARE-Nrf2荧光素酶实验方法的术语、定义、实验方法。本标准适用于化妆品原料和成品皮肤致敏体外筛选试验。本标准可作为皮肤致敏动物试验的替代方法之一。可以结合其他皮肤致敏替代试验，对皮肤致敏效应进行综合评价。本标准可作为其他领域皮肤致敏体外测试的参考方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新
2、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2285化妆品体外替代试验实验室规范3术语和定义3.1DSens细胞系转染了选择性质粒的HaCaT角质细胞3.2ARE抗氧化反应元件。3.3Keap1是一种能调节Nrf2活性的传感器蛋白。3.4Nrf2参与抗氧化反应通路的转录因子。3.5诱导倍数经受试物处理的细胞的荧光值与溶剂对照荧光值的比率。3.6Imax与溶剂对照相比，荧光素酶活性的最大诱导倍数3.7变异系数通过将标准差除以平均值来计算一组复制数据的变异性的度量。表达式的百分比可以乘以100。3.8EC1.5荧光素酶基因诱导表达为1.5倍时的受试物浓度。3.9IC30细胞活力降低30%的受试物
3、浓度。43.10IC50细胞活力降低50%的受试物浓度。4原理DSens是一个基于转染了选择性质粒的HaCaT角质细胞系作为检测系统的方法。Keap1-Nrf2-ARE信号通路可以通过控制抗氧化酶或者蛋白的表达来保护细胞不受氧化应激的损伤，该信号通路可以被皮肤致敏物激活。DSens细胞系含有荧光素酶基因，由一个与ARE元件融合的组成性启动子的转录控制。荧光素酶信号反映了内源性Nrf2依赖基因的致敏物激活状态，并且证实了重组细胞系中荧光素酶信号对Nrf2的依赖性。此方法通过定量检测由Keap1-Nrf2-ARE反应通路激活引起的荧光素酶基因表达情况，作为皮肤致敏的反应量化指标。DSens细胞的构
4、建方法：将融合了SV40启动子的ARE元件构建到含有荧光素酶的质粒上，将质粒转入HaCaT细胞，利用G-418筛选稳转细胞株，并通过PCR的方法确定基因的表达。5测试系统5.1DSens测试系统DSens是来源于选择性质粒转染的HaCaT人角质细胞的永生细胞系，该质粒含有荧光素酶基因。采用DMEM细胞培养液，含FBS和遗传霉素，1青霉素和1链霉素，于5C02、37细胞培养箱常规培养。5.2受试物与对照5.2.1溶剂对照1DMSO作为溶剂对照组5.2.2阳性对照本实验中，采用肉桂醛作为阳性对照，浓度分别为4，8，16，32，64mol/L。5.2.3空白对照测定空白的补偿光密度，孔里加入DPBS
5、，不含细胞。5.2.4受试物浓度0.9765625，1.953125，3.90625，7.8125，15.625，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000molL。6仪器与试剂耗材6.1仪器6.1.1II级生物安全柜6.1.2二氧化碳培养箱温度371，湿度90%5%，5%1%CO2浓度）6.1.3恒温水浴箱（温度371）6.1.4荧光读板机6.1.5DSens细胞系56.1.6全波长酶标仪6.1.7电子天平6.1.8细胞计数仪6.1.9离心机6.1.10烘箱6.1.11移液枪6.1.12液氮罐6.1.13排枪6.1.14细胞冻存盒6.1.15振荡器6.1.16倒置显微镜
6、6.2试剂耗材6.2.1DMEM培养基（DulbeccosModifiedEagleMedium）6.2.2胎牛血清（FBS）（56加热灭活30min）6.2.30.25%胰酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA）6.2.4青霉素/链霉素双抗（工作溶液青霉素（100U/mL）、链霉素（100g/mL）6.2.5遗传霉素G-4186.2.6二甲基亚砜（DMSO）6.2.7细胞冻存培养基（含20%FBS、10%DMSO的DMEM培养基）6.2.8磷酸盐缓冲液（DPBS）6.2.9荧光素酶检测试剂盒6.2.10反式肉桂醛6.2.11CCK-8试剂6.2.12无菌离心管6.2.13细胞培养瓶及培养
7、板（25cm2、75cm2培养瓶、96孔平底细胞培养板）。7试验方法7.1实验溶液配制维持培养所用的培养基：10%FBS的DMEM细胞培养液,加入遗传霉素，过滤除菌，加入青霉素（100U/mL）、链霉素（100g/mL）。冻存所用的培养基：含有20的胎牛血清和10DMSO的DMEM受试物暴露时所用的培养基：含1胎牛血清DMEM培养基，无遗传霉素。受试物的制备：受试物溶于DMSO或者培养基中，浓度范围设置为：0.98-2000molL（间隔系6数为0.5）的12个终浓度，确保DMSO的终浓度在1%或者更少。阳性物质为肉桂醛，设置5个浓度，4-64molL（间隔系数为0.5），溶剂对照为DMSO,
8、设置同浓度的六个孔作为参照。7.2细胞培养7.2.1DSens细胞培养及质控DSens细胞系应在，在371，湿度90%5%，CO2浓度5.0%1%条件下进行培养，选择25代之内的细胞进行试验。所有细胞培养相关操作步骤都应在II级生物安全柜里进行，确保无菌操作。7.2.2DSens细胞培养传代DSens细胞培养到80%-90%后需要进行传代，吸掉原培养液，DPBS清洗一次，加入0.25%胰酶/EDTA溶液（25cm2培养瓶0.5mL,75cm2培养瓶1mL）进行消化,尽量使胰酶覆盖培养瓶的整个底面，在显微镜下观察，5-10min左右可见细胞变圆脱壁，立刻加入2mL3mLDMEM完全培养基终止消化
9、，离心，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照实验需求，1：3到1：12传代。7.2.3DSens细胞冻存选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶/EDTA溶液消化细胞，将细胞转移到15mL无菌离心管中，200g，离心5min，弃上清，重悬细胞于冻存培养液（FBS20%,DMSO10%）调整细胞浓度为3-4106/mL。用吸管轻轻吹打使细胞分散均匀，分装至无菌冻存管，每管1mL。可以使用程序降温仪进行细胞冻存，也可以将细胞冻存管放入细胞冻存盒中-70条件下放置3h后，将细胞冻存管放到液氮罐支架上，从液氮罐口慢慢移至液氮液面上（未触及液氮）停留1h左右，将其没入液氮中。7.2.4DSens细胞复苏从液氮罐中
10、取出冻存管，迅速置于37恒温水浴箱中，轻轻摇动使其尽快融化。从水浴锅中取出冻存管，表面用75%乙醇消毒，无菌吸管吸出细胞悬液加入7mL10mLDMEM完全培养基中，转到T25细胞培养瓶中，于二氧化碳培养箱中进行培养(复苏首代不要加G-418，下次传代后再加)，第二天换液。7.3实验方法7.3.1细胞铺板在测试前一天，将培养到80%-90%汇合的细胞消化，离心、去上清，用新鲜完全培养基重悬细胞，8，0000个细胞/ml，每孔添加125ul，达到10，000个细胞/孔，在铺板的过程中注意避免细胞沉降，确保每孔细胞数量能基本一致。置于37、5C02培养箱孵育24h。每一次实验，至少三个平行孔用于荧光
11、素酶活性测定，至少一个平行孔用于细胞活力测定。7.3.2受试物制备试验的受试物和对照物质需在试验当天准备。受试物溶在二甲基亚砜(DMSO，CASNo.67-68-5)中，达到最终所需浓度。DMSO溶液有杀菌功能，所以无需无菌过滤。不溶于DMSO的受试物溶在无菌的水或培养基中，这些溶液通过过滤等方式消毒。对于没有确定分子量(MW)的试验化学品，其默认浓度为40mg/mL或4%(w/v)。如果使用DMSO以外的溶剂，则应提供适当的科学依据。受试物作用于细胞的最高浓度2mmol/L。根据被测受试物的原液浓度，用DMSO或合适的溶剂(即无菌水或培养基)进行连续稀释，得到12个梯度浓度(0.098-20
12、0mol/L)。除所用溶剂外，主浓度被进一步稀释25倍于含血清的培养基中，最后再用4倍稀释倍数处理，使被测化学物质的最终浓度在0.98至2000mol/L之间(根据稀释系数2)。正式实验开始之前可以进行一次预试验，以确定受试物浓度的使用区间。可根据理由使用替代浓度(例如，在细胞毒性或溶解性差的情况下)。对于未确定分子量的试验化学品，使用DMSO或适当的溶剂进行梯度稀释，以获得所需的试验化学品的最终浓度(例如，12种浓度在0.196至400g/ml之间)。77.3.3受试物干预细胞接种24小时后，用真空吸液泵或排枪将孔中的培养基去除，每个受试物做1列6个复孔，用排枪由96孔板的第2列开始加样，分
13、别加入溶剂对照、制备好的受试物（C1C8）、溶剂对照，每孔125L，边缘的孔加入125LDPBS。将孔板继续放培养箱培养48小时。7.3.4细胞生存率测试受试物孵育48小时后，DPBS清洗一次。在每孔中分别加入100LDMEM完全培养基和10LCCK-8溶液，置于二氧化碳培养箱中，培养3h左右。在450nm波长，测定吸光度（OD）值。注：CCK-8试剂可以用MTT代替。MTT工作溶液配制时必须保证MTT结晶的完全溶解。7.3.5荧光素酶活性测试根据上述设置的浓度和铺板设置，孵育48h后弃去上清液，使用DPBS清洗一次细胞。使用荧光素酶检测试剂盒检测，荧光读板机进行荧光读数。值得注意的是，进行荧
14、光读数的板应该是白板，若细胞培养时用的是透明的96孔板，需在加入荧光素酶底物后将溶液转移到白板进行读数。7.3.6结果计算1.诱导倍数计算诱导倍数（I）=（L受试物-L空白）/（L溶剂-L空白）式中：L受试物受试物荧光读数；L空白空白（不含细胞不含受试物）荧光读数；L溶剂溶剂对照（阴性对照）荧光读数均值。2.EC1.5计算EC1.5=（Cb-Ca）*（(1.5-Ia)/（Ib-Ia）+Ca式中：Ca诱导值大于1.5时的受试物最低浓度，molL；Cb诱导值小于1.5时的受试物最高浓度，molL；La大于1.5时受试物最低浓度对应的诱导值（平行均值）；Lb小于1.5时受试物最高浓度对应的诱导值（平
15、行均值）。3.细胞活性计算细胞活性=（V受试物-V空白）/（V溶剂-V空白）*100式中：V受试物受试物的吸收值；V空白空白（不含细胞不加受试物）的吸收值；V溶剂溶剂对照的吸收均值。4.ICx计算ICx=（Cb-Ca）*(100-x)-Va)/（Vb-Va）+Ca式中：X要计算的抑制率百分比（%，如IC50或者IC30）Ca抑制率大于x%的最低浓度，mol/L；Cb抑制率小于x%的最高浓度，mol/L；Va抑制率大于x%的最低浓度下的细胞活率（%）；Vb抑制率小于x%的最高浓度下的细胞活率（%）。7.4可接受的标准8a阳性对照肉桂醛（4-64mol/L）的结果必须是阳性的，因此肉桂醛至少有一个
16、浓度的基因诱导倍数大于1.5，并且有统计学意义。b阳性对照的EC1.5值应在历史均值的两个标准差内(例如，根据验证数据集，在7mol/L至30mol/L之间)，应定期更新。64mol/L的肉桂醛的三次实验的诱导倍数需在2-8之间，上述两项至少有一项是要符合的，否则数据视为不合格，丢弃。如果不符合后一标准，则应仔细检查肉桂醛的剂量反应，只有在阳性对照出现明显的剂量反应，并在浓度增加时诱导荧光素酶活性增加时，才能接受。c对照组荧光读数的平均变异系数应在每次重复中小于20%。如果可变性较高，则应放弃结果。7.5结果判断a对于任何一个结果的判定都要经过至少两次独立的实验，每次实验至少三个平行，如果两次
17、结果不一致，则应进行第三次实验。实验应在不同的时间，所用受试物必须新鲜配制。b阳性结果的判定：两次或三次实验的结果都满足以下四条，则被预测为阳性结果，否则为阴性。i受试物的最大诱导倍数Imax大于等于1.5，与对照相比有显著性差异（t-test）；iiEC1.5浓度下细胞的存活率大于70%；iiiEC1.5浓度小于1000molL，或者未确定分子量的受试物小于200g/mL；iv荧光素酶诱导有明显的剂量依赖性增加。如果在给定的重复中，所有三个第一条件都得到满足，但不能观察到荧光素酶诱导的明显剂量依赖性的增加，那么这种重复的结果应该被认为是不确定的，可能需要进一步的测试。此外，在最大试验浓度10
18、00微克/毫升(或对未确定分子量的试验化学品为200微克/毫升)且在最高试验浓度时细胞活力10001000Lacticacid乳酸50-21-5液体非致敏物Cat.6阴性10001000Glycerol甘油56-81-5液体非致敏物Cat.6阴性10001000Isopropanol异丙醇67-63-0液体非致敏物Cat.5阴性10001000Ethyleneglycoldimethacrylate二甲基丙烯酸二醇酯97-90-5液体致敏物（轻微）Cat.4阳性5-125500Cinnamylalcohol肉桂醇104-54-1固体致敏物（轻微）Cat.3阳性25-17510002-Merca
19、ptobenzothiazole2-巯基苯并噻唑149-30-4固体致敏物（中度）Cat.3阳性25-2505004-Methylaminophenolsulfate4-甲氨基苯酚硫酸盐55-55-0固体致敏物（重度）Cat.3阳性12.520-200Methyldibromoglutaronitrile甲基二溴戊二腈35691-65-7固体致敏物（重度）Cat.2阳性2020-1002,4-Dinitro-chlorobenzene2，4-二硝基氯苯97-00-7固体致敏物（极度）Cat.1阳性12.55-20Cat.1,代表接触过敏的明确证据;Cat.2，引起接触过敏的常见原因；Cat.3，引起接触过敏的普遍原因；Cat.4，引起接触过敏偶然原因；Cat.5，引起接触过敏的罕见原因；Cat.6，基本上没有接触过敏的证据_10