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1、一、试验目的血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。血凝抑制试验：应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒检测鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状态。掌握血凝和血凝抑制试验的原理和操作方法，能够正确判定试验结果第1页/共19页二、血凝试验(hemagglutination test)原理 病毒粒子上的血凝素蛋白与红细胞特定表面受体相结合，引起特异性凝集。血凝现象：有些病毒可凝集某些动物（如鸡、鹅、豚鼠、绵羊）和人的红细胞。第2页/共19页HAHA试验的原理示意图试验的原理示意图第3页/共19页用途：1确定病毒的存在；2测
2、定病毒的血凝价血凝价：能使一定量红细胞发生50%凝集的 病毒最高稀释度第4页/共19页第5页/共19页第6页/共19页第7页/共19页实验材料器材：96孔V型微量反应板、微量移液器、枪头试剂：1%鸡红细胞(采集健康鸡血液，以阿氏液抗凝，用PBS洗涤3-5次，用PBS配成1%红细胞悬液备 用)。试验抗原、PBS缓冲液第8页/共19页血凝实验步骤1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ulPBS缓冲液，第11孔不加。第12孔 加25ulPBS缓冲液2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第 2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推 至第1
3、0孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感 作15-30min，每5min观察一次结果。5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用第9页/共19页结果判定结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定 血凝反应强度示意图“4”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2”红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的
4、情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。第10页/共19页第11页/共19页血凝抑制试验步骤1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul PBS缓冲液，第11孔不加。第12孔加25ul PBS缓冲液。2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡后，室温静止作用40min。4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震
5、荡，室温30min。5.观测结果，记录实验数据第12页/共19页血凝抑制试验结果判定测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)凝集 （-）病毒对照孔：凝集RBC对照孔：无自凝血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血清稀释度。第13页/共19页第14页/共19页第15页/共19页第16页/共19页思考题1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应？为什么？2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应?为什么？3、血凝试验中为什么要加补充液？4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？第17页/共19页孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)
6、12（-)HA稀释度248163264128256、弃PBS25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素xPBS2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测+-+_孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HI稀释度248163264128256、弃PBS25252525252525252525X25待检血清2525252525252525252525x4HA血凝素2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测-+-+第18页/共19页感谢您的观看！第19页/共19页