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1、血凝和血凝抑制实验内容内容一、重要性二、检测内容和方法三、血凝和血凝抑制试验一、重要性动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动物进行有效的免疫接种后，才能在产生一定的保护力，从而防止疫病的侵入和蔓延。因此在畜禽生产过程中,在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测，准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握全市畜禽规模养殖场的免疫抗体水平和动物疫病保护情况，从而更有效地采取综合防控措施。因此，做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。有效预防动物疫情的发生有效预防动物疫情的发生01有效判断动物疫情发生的原因有效判断动物疫情发生的原因02有效推动动物免疫程序的制定有效推
2、动动物免疫程序的制定03一、重要性二、检测内容和方法猪猪猪瘟猪瘟O型口蹄疫型口蹄疫A型口蹄疫型口蹄疫地方病：蓝耳、细地方病：蓝耳、细小、圆环、伪狂犬、小、圆环、伪狂犬、乙脑乙脑牛牛O型口蹄疫型口蹄疫A型口蹄疫型口蹄疫羊羊O型口蹄疫型口蹄疫小反刍兽疫小反刍兽疫鸡鸡禽流感禽流感新城疫新城疫检测内容检测内容二、检测内容和方法检测方法检测方法禽流感：禽流感：（H5+H7）三价）三价灭活疫苗灭活疫苗（H5N1 Re-8株株+H7N9 H7-Re1株）株）鸡新城疫鸡新城疫血凝与血凝抑制血凝与血凝抑制猪瘟猪瘟O型口蹄疫型口蹄疫A型口蹄疫型口蹄疫地方病：蓝耳、地方病：蓝耳、细小、圆环、伪细小、圆环、伪狂犬、乙
3、脑狂犬、乙脑小反刍兽疫小反刍兽疫酶联免疫吸附酶联免疫吸附ELISA布病布病虎红平板和试虎红平板和试管凝集管凝集血凝试验：某种病毒的血凝素，能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝集，叫做血凝试验，集，叫做血凝试验，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)。常见于正粘病毒、副粘病毒和某些黄病毒、痘病毒等。目的：测定病毒的血凝效价病毒的血凝效价，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴定该特异性抗体的水平。三、血凝与血凝抑制实验（禽流感和鸡新城疫）血凝素（血凝素（HAHA）柱状柱状刺突：亚型特异性抗原，易变异刺突：亚
4、型特异性抗原，易变异 血凝素（血凝素（HAHA，从，从H1H1H15):H15):呈柱状呈柱状 功能：功能：吸附细胞：与细胞上受体结合吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒使病毒侵入细胞侵入细胞凝集多种动物的红细胞（血凝试验）凝集多种动物的红细胞（血凝试验）具抗原性：其抗体能中和病毒具抗原性：其抗体能中和病毒-中和抗体中和抗体 抑制血凝（血凝抑制试验）抑制血凝（血凝抑制试验）血凝素（血凝素（HAHA）柱状柱状血凝抑制试验：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反
5、应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验血凝试验(HI)(HI)。该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。目的：检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状态。三、血凝与血凝抑制实验（禽流感和鸡新城疫）血凝试验血凝试验（HA)HA)原理：原理：血凝抑制试验（血凝抑制试验（HIHI）原理）原理 病毒的悬液中加入特异性抗体，红细胞的凝集现象被抑制，称为红细胞的血凝抑制。？+主要实验器材：微量移液器普通离心机微量振荡器禽用采血器96孔血凝反应板试验主要试剂：试验主要试剂：标准抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清标准抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清1%1%鸡红细胞悬液（阿氏
6、液）鸡红细胞悬液（阿氏液）四单位抗原四单位抗原生理盐水（生理盐水（PBSPBS液）液）阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。1%1%红细胞的配制：红细胞的配制：1.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与血液比例为1:4）2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以20003000r/min，510min离心3-5次。3.
7、弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。4.吸取压积红细胞泥与生理盐水以1:99进行配制1%鸡红细胞悬液。5.在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞均匀，使其每孔加入相同数量的红细胞。6.制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。四、血凝试验操作步骤倒倒加加血凝试验操作步骤血凝试验操作步骤4 4个个100%100%血凝单位（即血凝单位（即4HA1004HA100）抗原的稀释倍数抗原的稀释倍数=使使100%100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数红细
8、胞凝集的抗原最高稀释倍数/4/4结果判定结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定 血凝反应强度示意图“4”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2”红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。四单位抗原是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对试验结果有重要的影响。抗原浓度高时，HI抗体效价就会降低；反之则会有所升高。抗原效价测量是否准确，决定了配制而得的四单位抗原准确性。血凝抑制试验操作步骤血凝抑制试验操作步骤血凝抑制试验结果判定：血凝抑制试验结果判定：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度（注：看结果时96孔板倾斜45度）。注意：确定度数的孔要与前一孔的流速及形状完全一样，即泪珠样流挂。读数要快，可以读到结束，一组（一板）时间不要超过30秒。