现代分子生物学-第九章.pptx

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1、经典单基因病。至今已发现6，000余种，主要病因是某个基因位点上产生了缺陷等位基因。多基因病。涉及多个基因及调控这些基因表达的环境因子之间的相互作用。大多数人类疾病，特别是危害较大的高血压、糖尿病、骨质疏松、精神及神经病等，都属于这一范畴。第1页/共191页获得性（acquired）基因病。主要是由病原微生物感染引起的传染病，虽然不符合经典的“世代遗传”方式，但基本上是病原微生物基因组与人类基因组相互作用的结果，都涉及基因结构与表达模式的改变。第2页/共191页第3页/共191页 癌基因（oncogene）：促进细胞增生，这类 基因往往常发生功能 突变。抑癌细胞（tumor suppresso

2、r gene,TSGs）:抑制细胞生长。抑癌 基因的活性下降（功 能缺失突变）是引起 癌变的另一个原因。第4页/共191页9.1.1 反转录病毒致癌基因Rous在1910年发现带有单链RNA肉瘤病毒（一种反转录病毒）的鸡肉瘤无细胞滤液能在鸡体内诱发新的肉瘤。第5页/共191页该病毒基因组为6-9kb，RNA上的基因数目很少，被包裹在由gag和env两个基因编码的蛋白质外壳中，其中env基因指导外壳蛋白的合成，gag基因则指导“鞘”蛋白的合成，这些“鞘”蛋白好像“道钉”一样“箍”在外壳的表面，维持外壳蛋白结构的稳定性。第6页/共191页该反转录酶再以病毒RNA为模板，转录出单链DNA分子，利用宿

3、主DNA聚合酶指导合成第二条DNA链，以双链DNA形式整合到宿主细胞基因组中。被整合的反转录病毒DNA分子称为原病毒（provirus），它能指导病毒mRNA的合成，并利用宿主细胞中的蛋白质合成机器，翻译生成病毒外壳蛋白等，最后组装成病毒颗粒。第7页/共191页图9-2 9-2 反转录病毒颗粒示意图 第8页/共191页DNA病毒包括乙型肝炎病毒、SV40和多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。RNA病毒主要是反转录病毒。反转录病毒致癌基因（retrovirus onc）可能是研究最多的病毒基因，它们能使靶细胞发生恶性转化。第9页/共191页反转录病毒的复制是由其自身基因组上pol基因

4、编码的反转录酶指导完成的。当该病毒感染细胞时，pol基因就被宿主的RNA聚合酶II转录，产生pol mRNA，并在宿主核糖体上合成包括反转录酶、整合酶等多个病毒复制和整合所需要的酶类。第10页/共191页图9-3 9-3 反转录病毒基因结构示意图 第11页/共191页该反转录酶再以病毒RNA为模板，转录出与病毒RNA序列互补的单链DNA分子，并以此为模板，利用宿主DNA聚合酶指导合成第二条DNA链，以双链DNA形式整合到宿主细胞基因组中。第12页/共191页图9-4 9-4 反转录病毒插入引起c-mycc-myc基因活化的几种可能途径。第13页/共191页最早研究的致癌基因可能是劳斯氏（Rou

5、s）肉瘤病毒中的V-Src基因，编码被称为p60Src的蛋白质。该蛋白是514个氨基酸的磷酸化蛋白，其C端250个氨基酸是活性区域，负责将磷酸基团移到酪氨酸残基上，可使多个靶蛋白发生磷酸化而影响其功能，加速细胞癌变的过程。第14页/共191页图9-5 9-5 劳斯氏肉瘤病毒基因结构及c-Srcc-Src原癌基因的转变 第15页/共191页V-onc基因的起源研究发现，反转录病毒基因组中所带有的onc基因并非来自病毒本身，而是这些病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。动物或人原癌基因经病毒修饰和改造后，成为病毒基因组的一部分并具有了致癌性，其作用的靶分子也往往发生改变。第16页/共191页

6、癌基因（oncogene）可分为两大类：一类是病毒癌基因（viral oncogene，V-onc），编码病毒癌基因的主要有DNA病毒和RNA病毒。第二类是细胞转化基因（C-onc），它们能使正常细胞转化为肿瘤细胞，这类基因与病毒癌基因有显著的序列相似性。第17页/共191页根据反转录病毒转化细胞的能力，可分为：1、急性转化型1）感染动物后，很短时间（几天或几周）就出现实体瘤或白血病。2）所带的癌基因一般位于病毒基因组内部，也可位于基因组的3端，但不会插入结构基因内部。3）具有体外转化细胞的能力。第18页/共191页2、非急性转化型。感染寄主后，需要较长时间（几个月，几年或数十年)才会致癌。第

7、19页/共191页研究发现，反转录病毒基因组中所带有的onc基因并非来自病毒本身，而是这些病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。在肿瘤细胞中，“生长控制点”不起作用，所以瘤细胞一直处于细胞周期循环之中。第20页/共191页细胞数量培养时间（天）癌细胞+血清生长因子癌细胞-血清生长因子正常细胞-血清生长因子正常细胞+血清生长因子第21页/共191页图9-6 9-6 上表皮癌的发生过程示意图 第22页/共191页9.1.2 原癌基因（细胞转化基因）产物及分类除病毒感染诱发细胞癌变外，许多非病毒因子（如放射性物质、化学试剂亚硝酸、烷化剂等）也能诱导细胞转化。这些因子没有把致癌基因或其他致癌的遗

8、传信息带入细胞，而通过某种激活机制改变了细胞内原有的遗传信息，使细胞发生恶性转化。研究证明，致癌因子导致基因突变。第23页/共191页图9-7 9-7 黄曲霉素（aflatoxinaflatoxin）导致细胞发生癌变的分子机制 第24页/共191页根据原癌基因产物在细胞中的位置，分为3类：1、与膜结合的蛋白，主要有erbB、neu、fms、mas和Src基因产物；2、可溶性蛋白，包括mos、sis和fps基因产物；3、核蛋白，包括myc、ets、jun和myb等。第25页/共191页根据这些蛋白的功能，它们又常被分为6大类，即蛋白激酶类、生长因子类、生长因子受体类，GTP结合蛋白类、核蛋白类和

9、功能未知类（表9-2）。第26页/共191页9.1.3 原癌基因的表达调控原癌基因在正常细胞中通常以单拷贝形式存在，只有低水平的表达或根本不表达。在很多情况下，原癌基因的结构发生了点突变或插入、重排、缺失及扩增等，改变其转录活性。第27页/共191页图9-8 9-8 细胞中原癌基因转变为癌基因的主要途径 第28页/共191页1.点突变研究发现，ras基因编码了一个分子量为2.1104癌蛋白（p21），从人类膀胱癌细胞系T24 DNA中克隆的Ha-ras基因能够诱发NlH/3T3细胞转化，而从正常细胞DNA中克隆的该原癌基因没有这种功能。第29页/共191页人类肺癌细胞系Hs242的转化基因与H

10、a-ras高度相似，在这个基因中导致转化活性的遗传损伤是第二个外显子中引起p21蛋白第61位谷氨酰胺被亮氨酸所替代的一个点突变，进而引起蛋白质构象的改变，使细胞获得转化活性。第30页/共191页图9-9 9-9 rasras基因的点突变及转化活性分析。第31页/共191页2.LTR插入。LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复序列（long terminal repeat），含有强启动子序列，当LTR插入原癌基因启动子区域或邻近部位后，可从根本上改变基因的正常调控规律。LTR插入到c-myc 5上游启动子附近，使c-myc的转录水平大大增加。第32页/共191页3.基因重排。正常情况下，c-m

11、yc定位于8q24，免疫球蛋白重链基因（IgH）定位于14q32，轻链基因（Ig）定位于22q12，轻链k基因（Igk）定位于2p11，。在Burkitt淋巴瘤中，c-myc易位至IgH、Igk或Ig的位点，使Ig基因与c-myc相连在一起，Ig基因启动子使原来不表达的c-myc高表达。第33页/共191页在正常人体细胞中，非受体型酪氨酸蛋白激酶基因abl位于第9号染色体上，表达量极低，不会诱发癌变。在慢性骨髓瘤病人细胞中，该基因却被转移到第22号染色体上，与bcr基因相融合，表达量大为提高。第34页/共191页图9-10 9-10 ablabl原癌基因通过选择性染色体重排转变成细胞癌基因 第

12、35页/共191页4.缺失。很多原癌基因5上游区存在负调控序列，一旦该序列发生缺失或突变，就丧失抑制基因表达调控的能力。如Burkitt淋巴瘤中C-myc可因负调控序列的缺失或LTR插入破坏其结构而增强表达。5.基因扩增。使每个细胞中基因拷贝数增加，从而直接增加可用的转录模板。第36页/共191页9.1.4 基因互作与癌基因表达1.染色体构象对原癌基因表达的影响。基因表达不仅取决于基因本身及其相邻区域的一级结构，也取决于其空间构象，即基因在染色体上的空间排列和染色质的结构。当两个基因相距太近时，往往不易形成有利于高效转录的空间结构。第37页/共191页基因与基因之间的间隔距离被定义为“基因领域

13、”（gene territory）。同一DNA链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低，产生所谓基因领域效应（gene territorial effect）。第38页/共191页正常人c-myc定位于第8号染色体，在其两侧分别存在强表达的基因，使c-myc处于两面受夹击的地位。在Burkitt淋巴瘤中，由于发生基因重排，使c-myc基因一侧的强表达基因消失，从而消除了对c-myc的基因领域效应，使后者的转录活性增强。第39页/共191页小鼠细胞中，c-myc的5上游区域也存在一个强表达基

14、因，全长15kb，距c-myc只有3kb。很显然，这一间隔距离太短，与基因有效转录应有的最小距离相差甚远，c-myc受基因领域效应的影响非常大，表达受抑制。在小鼠乳腺癌细胞中，上述间隔距离被显著拉长，激活c-myc转录。第40页/共191页2.原癌基因终产物对基因表达的影响。癌基因产物通过介质传递生长刺激信号的部位有3处：癌基因产物本身模拟了生长因子，因而与相应的受体作用，以自分泌的方式刺激细胞生长；癌基因产物模拟了已结合配体的生长因子受体，从而在无外源生长因子时提供了促进细胞分裂的信号；第41页/共191页癌基因产物作用于细胞内生长控制途径，解除此途径对外源刺激信号的需求。人血小板衍生生长因

15、子（PDGFPDGF）与猴肉瘤病毒（SSVSSV）的V-rasV-ras癌基因产物，上皮生长因子（EGFEGF）与SrcSrc及V-erbV-erb癌基因产物之间都存在着极高的相似性，表明生长因子与癌基因转化有关。第42页/共191页3.抑癌基因产物对原癌基因的调控。因为抑癌基因产物能够抑制细胞的恶性增殖，所以它被认为是一种隐性癌基因。当细胞内由于某种原因造成这些基因的表达受抑制时，原癌基因就活跃表达，引起细胞癌变。第43页/共191页p53基因，Guardian of the genome1990年，科学家首次发现p53是一个肿瘤抑制基因。缺失该基因时，患Li-Fraumeni Syndro

16、me。此外，病人极易患乳腺癌，脑癌和白血病。第44页/共191页p53基因在星形细胞癌、乳癌、肺癌、肠癌及骨肉瘤中都有高频率缺失现象。从癌细胞中得到的p53基因，其保守序列区有单一位点的突变，推测可能由于这一突变导致p53基因产物结构与功能的改变，失去抑癌活性。第45页/共191页磷酸化DNA损伤磷酸化与BRCA2及mRAD51协同作用，通过同源重组的方式完成双链DNA损伤修复激活细胞周期调控机制，停止DNA合成，启动DNA损伤修复。第46页/共191页p53基因中最常见的单碱基突变所造成的氨基酸改变.第47页/共191页第48页/共191页p53p53基因与细胞癌变a.a.正常情况下，细胞分

17、裂与p53p53基因无关；b.b.如果细胞中受损，p53p53基因被激活，使细胞受阻于阶段直到被修复或 启动细胞凋亡程序；c.c.如果细胞中p53p53基因的两个拷贝同时被破 坏，细胞可能死于有丝分裂过程中，也 可能带着损伤继续分裂，导致恶性肿瘤第49页/共191页DNA损伤P53含量升高，G1停滞细胞在DNA修复后继续分裂或者发生细胞凋亡(a)(b)第50页/共191页没有p53基因没有G1停滞带有DNA损伤的细胞分裂，细胞的倍性发生变化DNA损伤有丝分裂失败,细胞死亡癌变C第51页/共191页Rb基因是从视网膜纤维瘤中克隆到的另一个抑癌基因，其功能是阻止处于G0/G1期的细胞进入S期，从而

18、控制细胞增殖。正常Rb基因的表达几乎可抑制所有培养细胞的分裂。第52页/共191页CDK4/cyclin D复合物使pRb磷酸化非活性转录调控因子转录调控因子有活性基因表达，细胞顺利通过一个细胞周期靶基因第53页/共191页4.外源信号对原癌基因表达的影响。细胞外信号（包括生长因子、激素、神经递质、药物等）作用于靶细胞后，通过细胞膜受体系统或其它直接途径被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶的活化，对转录因子进行修饰，然后激活一系列基因转录。第54页/共191页图9-11 9-11 许多原癌基因参与细胞信号转导过程 第55页/共191页香烟食物中的污染物黄曲霉素 B1太阳光照射脱氨内源生理代谢，如

19、肝脏解毒功能等脱氨第56页/共191页9.2 人免疫缺损病毒HIV人免疫缺损病毒（HIV），俗称艾滋病毒（AIDS），诱发人类获得性免疫缺损综合症。该 病 毒 在 分 类 上 属 反 转 录 病 毒 科（Retroviridae）慢病毒属中的灵长类免疫缺损病毒亚属。1983年，法国巴斯德研究所的Montaginer和美国国家卫生研究院癌症研究所Gallo等人首次证实HIV是艾滋病的病因。第57页/共191页HIV I是从欧洲和美洲分离的毒株，与猴艾滋病毒只有约45%的相似性，它的致病力很强，是引起全球艾滋病流行的主要病原。HIV研究主要针对HIV I。HIV II与猴艾滋病毒的相似性高达75%

20、，其毒力较弱，引起艾滋病的病程较长，症状较轻，且主要局限于西部非洲。第58页/共191页第59页/共191页9.2.1 HIV病毒粒子的形态结构和传染艾滋病病毒粒子是一种直径约为100nm的球状病毒，包被着由两层脂质组成的脂膜，这种结合有许多糖蛋白分子（主要是gp41和gp120）的脂质源于寄主细胞的外膜。蛋白质p24和p18组成其核心，内有基因组RNA链，链上附着有反转录酶。第60页/共191页HIV依靠血、血制品以及人体分泌的奶液和精液等传播，主要感染T淋巴细胞，也感染B淋巴细胞和单形核细胞等。HIV感染形成多核巨细胞，并导致细胞死亡。HIV病毒可以通过所感染细胞扩散到全身，已在淋巴细胞、

21、脑、胸腺、脾等组织发现了该病毒。自然界广泛存在着突变株。第61页/共191页图9-12 HIV-I9-12 HIV-I病毒粒子结构模型图 第62页/共191页9.2.2 HIV基因组及其编码的蛋白1.HIV基因组结构HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7kb。在RNA5端有一帽子结构（m7G5GmpNp），3端有多聚(A)尾巴。由5末端LTR、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3未端LTR组成。第63页/共191页HIV HIV I I基因编码区有很多重叠，尤其在基因组的3 3端。HIVHIV基

22、因组中的部分基因如TatTat和RevRev是不连续的，被插入的内含子分隔成两个外显子。HIV HIV I I至少有4 4个功能性的剪接供体位点和6 6个受体位点。第64页/共191页图9-13 HIV-I基因组结构及所编码的主要蛋白质 第65页/共191页2.HIV编码的蛋白质及其主要功能 HIV的结构蛋白主要包括3个基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个5.5105.5104 4的前体(p55)(p55)，然后在HIVHIV蛋白酶的作用下被切割成p17p17、p24p24、p15p15三个蛋白。P24P24和p17p17分别组成HIVHIV颗粒的外壳（CACA）和内膜蛋白(M

23、A)(MA)，p15p15进一步被切割成与病毒RNARNA结合的核衣壳蛋白(NC)p9(NC)p9和p7p7。第66页/共191页PolPol基因编码病毒复制所需的酶类包括逆转录酶p66p66、整合酶p32p32。从polpol和gaggag基因重叠区内起始的一段序列为propro基因，它编码蛋白酶p22p22，在切割HIVHIV蛋白前体的过程中起作用。envenv编码8.8108.8104 4的蛋白质，经糖基化后其相对分子质量增至1.6101.6105 5，是HIVHIV包膜糖蛋白Gp160Gp160的前体，可进一步被切割成Gp120Gp120和Gp41Gp41。第67页/共191页Gp12

24、0Gp120是外膜蛋白，感染细胞时可与细胞的CDCD4 4受体蛋白相结合，并与G G蛋白偶联受体（GPCRGPCR）家族中的一个跨膜蛋白发生相互作用。Gp41Gp41是跨膜蛋白（TMTM），嵌入病毒包膜脂质中，对HIVHIV的侵染和致病有非常重要的作用。第68页/共191页图9-14 HIV I9-14 HIV I感染小神经质细胞和巨噬细胞过程中信号传导及与其受体CDCD4 4和辅助受体相互作用示意图。第69页/共191页3.HIV膜蛋白主要功能区（1 1）主要抗原决定簇：包括V3V3区（第301-324301-324位的环状肽段）的主抗原决定簇及若干个较弱的决定簇，其中有两个分别位于Gp41

25、Gp41的616-632616-632位和724-751724-751位。第70页/共191页（2 2）T T细胞决定簇：两个辅助性T T细胞决定簇T2T2和T1T1分别在105-117105-117位的C1C1区和421-436421-436位的C4C4区，一个主要细胞毒T T细胞决定簇位于第308-308-322322位。另有3 3个较弱的细胞毒T T细胞决定簇在Gp41Gp41上。第71页/共191页（3 3）CDCD4 4受体结合区：该区位于423-427423-427位（C4C4区）。在上述功能区以外的某些氨基酸突变也能影响gp120gp120的功能，说明上述各功能区发挥作用还依赖于

26、整个分子特定的空间构象。第72页/共191页9.2.3 HIV9.2.3 HIV的复制HIVHIV与受体结合后，病毒核心蛋白和两条RNARNA链进入细胞。反转录酶以病毒RNARNA为模板合成单链DNADNA，并由宿主细胞DNADNA聚合酶合成双链DNADNA（原病毒），经环化后进入细胞核并整合到染色体上，随细胞的分裂传代可长期潜伏。第73页/共191页 主要过程如下：原病毒整合到宿主染色体上，无症状；原病毒利用宿主细胞的转录和合成系统转录产生病毒mRNAmRNA，其中一部分编码病毒蛋白，与基因组RNARNA组装成新的病毒颗粒，从寄主细胞中释放出来侵染其它健康细胞；寄主细胞瓦解死亡。第74页/共

27、191页图9-15 9-15 HIV-I在人体细胞内的复制和侵染过程示意图 第75页/共191页HIVHIV的感染及致病机理HIVHIV感染人体后大量复制和扩散，血清中出现HIVHIV抗原，从外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞中均能分离出HIV,HIV,是HIVHIV原发感染的急性期。大约70%70%以上的原发感染者在感染后2-42-4周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大、关节痛、中枢及外周神经系统病变、皮肤斑丘疹、粘膜溃疡等，持续1-21-2周后进入HIVHIV感染的无症状潜伏期。第76页/共191页无症状潜伏期（可长达数年）。此时无任何临床症状，外周血中HIVHIV抗原含量很低甚至检

28、测不到。随感染时间的延长，HIVHIV重新开始大量复制并造成免疫系统损伤。临床上病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病（PGLPGL）、艾滋病相关综合症（APCAPC）等，直至发展到艾滋病。第77页/共191页HIVHIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可通过以下几种途径导致免疫功能下降：HIVHIV粒子表面的gp120gp120蛋白脱落，与正常细胞膜上CDCD4 4受体结合，使该细胞被免疫系统误认为病毒感染细胞而遭杀灭；因T T细胞CDCD4 4受体被gp120gp120封闭，影响了其免疫辅助功能；第78页/共191页HIVHIV的gp120gp120蛋白可刺激机体产生抗CDCD4 4结

29、合部位的特异性抗体，阻断T T细胞功能；带有病毒包膜蛋白的细胞可与其他细胞融合形成多核巨细胞而丧失功能。第79页/共191页9.2.4 HIV9.2.4 HIV基因表达调控HIVHIV的最大特点是含有许多调控基因，它们编码调控蛋白，在病毒RNARNA的转录、转录后加工、蛋白质翻译、包装以及病毒颗粒的释放等各个过程中发挥重要作用。除HIVHIV自身的调控蛋白外，还有许多寄主细胞的调控蛋白也参与这个过程。因此，HIVHIV复制的调控十分复杂。第80页/共191页1.LTR序列HIV基因组两端，在HIV I与HIV II及SIV之间的保守性达95%以上。LTR 5端含有HIV基因调控所必需的多个特定

30、调控区（真核类增强子和启动子单位），现根据各区调控功能的异同分为调控单位、核心单位和反式激活效应元件单位，并已在LTR中发现了许多细胞转录因子结合位点。第81页/共191页图9-16 9-16 HIVHIV基因组LTRLTR区中的DNADNA和RNARNA结合蛋白的作用位点。第82页/共191页包括：（1）核心调控元件。该元件从LTR起始延伸到-78位核苷酸，至少包含6个可与细胞转录调控因子结合的区域。这些转录因子的结合部位如下：鸡卵蛋白转录因子（COUP-TF），结合于LTR-371334位；激活蛋白1（activator protein 1,AP1），结合于LTR的-347329位；第83

31、页/共191页激活T细胞核因子（NFAT），有两个结合位点，分别在-292-255位和-216-203位；上游激活因子(USF)，结合于-173-160位；T细胞因子-1(TCF-1)，结合于-139124位；核因子kB(NF-B)，结合于-10481位。除COUP-TF和USF对HIV的转录起负调控作用外，其余均为正调控因子。第84页/共191页（2 2）核心转录单位。HIVI LTRHIVI LTR核心转录单位的结构与其他病毒或细胞启动子的转录起始区相似，有TATATATA区和SP1SP1结合位点。这些序列对转录的激活具有重要作用，一旦缺失将使LTRLTR失去启动子活性。第85页/共191

32、页核心转录单位-78-784646位点的富含GCGC区有3 3个连续的SP1SP1结合位点(SP1(SP1蛋白含有DNADNA结合结构和两个富含谷氨酰胺的结构域，可形成二聚或三聚体)。3 3分子SP1SP1与LTRLTR结合后，由于彼此间以及SP1SP1与周围蛋白的相互作用改变了DNADNA的空间结构，诱导了依赖于DNADNA的蛋白激酶对SP1SP1的磷酸化作用，激活HIVIHIVI基因转录。第86页/共191页HIVI LTRHIVI LTR的-28-282424位含有TATATATA元件，其两侧还有一个CAXXTGCAXXTG的同向重复序列，该重复序列可能是转录因子螺旋-环-螺旋DNADN

33、A结合蛋白的识别位点。第87页/共191页（3 3）反式激活因子应答元件。在HIVHIV基因组+1+1+60+60位的核苷酸序列是反式激活因子（TatTat）激活HIV I HIV I 转录所必需的，称为反式激活应答元件（TARTAR）。该序列存在于HIVHIV基因组RNARNA和原病毒DNADNA上，是HIV HIV 复制所不可缺少的重要调控位点。第88页/共191页2.参与HIV复制的调控蛋白（1）Tat蛋白是一个转录激活因子，在HIV I、HIV II和SIV中高度保守，是病毒复制所必需的。HIV I的tat基因与env编码区有部分重叠，它含有两个外显子，编码了由101个氨基酸残基组成的

34、Tat蛋白。第一个外显子所编码的67个氨基酸组成的多肽同样具有反式激活作用。第89页/共191页图9-17 9-17 TatTat蛋白的结构示意图 第90页/共191页Tat蛋白有3个功能域：与已知转录调控蛋白激活功能区结构基本一致的酸性氨基酸区，与Tat激活HIV I基因表达有关；富含Cys区，有7个Cys，与二价金属离子结合并形成Tat二聚体。其中有6个是维持Tat活性所必需的，替代任意一个均可使Tat失活但不影响Tat与金属离子结合。该肽段能与3.0104的寄主细胞核蛋白相结合。第91页/共191页Tat的第三个功能区由带正电的碱性氨基酸残基构成，行使两个功能：一是+48+52位的GRK

35、KR序列，是核-核仁定位信号，可介导自身或异种蛋白进入细胞核；二是与TAR RNA凸出部的特异性结合，通过Tat第52和第53位Arg残基与后者的磷酸基团相互作用得以实现。第92页/共191页（2）Tat 与TAR对HIV复制的协同调控作用实验表明，Tat和TAR结合并不能有效地激活HIV基因表达：a.TAR序列及完整高级结构的影响。Tat虽能结合环区有突变的TAR蛋白，但此时不能激活HIV的表达。第93页/共191页b.寄主细胞因子协同作用的影响。在不同细胞内，Tat的活性可有上千倍的差异。Tat与TBPI结合形成复合体而发挥作用，说明Tat与TAR对HIV复制的调控还需寄主细胞编码蛋白的协

36、同作用。第94页/共191页c.对上游启动子和增强子的依赖。Tat-TAR功能的发挥依赖于其上游的启动子及增强子，当TAR远离上游启动子时，活性迅速下降。增强子SP1序列在Tat诱导细胞中对HIV转录的促进作用大于非激活细胞。NF-B序列对两种细胞的作用正好与SP1相反。TATA启动子序列的改变对未激活细胞影响很小，却可降低HIV在Tat诱导细胞中的复制。第95页/共191页（3 3）RevRev蛋白。revrev基因由两个外显子组成，分别编码2525个氨基酸和9191个氨基酸的两个肽段，最终组装成有116116个氨基酸、相对分子质量为1.9101.9104 4的调控结构蛋白表达活性的RevR

37、ev蛋白，是一个重要的反式激活因子，调控RNARNA剪切和运输，与RRERRE结合增加envenv的翻译。对HIVHIV的许多调控蛋白编码基因有负调控作用，对其结构蛋白基因有正调控作用。第96页/共191页图9-18 9-18 RevRev蛋白的结构示意图 第97页/共191页RevRev蛋白通过与envenv和gag/pol mRNAgag/pol mRNA上的一段234234个核苷酸的RevRev效应元件实现其功能，具有HIVIHIVI特异性。能增加含有RevRev效应原件RNARNA的稳定性，促进它们向细胞质运转，并通过阻碍剪接子的组装抑制RNARNA的编辑，增加这些mRNAmRNA的翻

38、译，促进HIVHIV基因表达由早期（转录调控蛋白mRNAmRNA）向晚期（转录HIVHIV结构蛋白mRNAmRNA）的转变。第98页/共191页RevRev蛋白和RRERRE（R Rev ev R Response esponse E Elementlement）的结合是通过RevRev蛋白中富含碱性氨基酸的一段1414肽（EGTRQARNRRRRWREGTRQARNRRRRWR）与RRERRE二级结构IIBIIB茎区特异性结合实现的。RevRev是核蛋白，带有核定位信号。第99页/共191页图9-199-19 RevRev蛋白与REEREE区的结合。第100页/共191页第一个RevRev与

39、RRERRE的结合有助于其他RevRev蛋白的结合，这些蛋白不是结合在RRERRE的特异位点上，而是直接结合到第一个RevRev蛋白上，形成多聚体。寄主细胞蛋白可结合到RevRev蛋白近C C端的功能区，协助加工和转运HIV mRNAHIV mRNA。第101页/共191页（4）Nef蛋白。是负调控因子和磷酸化蛋白，相对分子质量为2.7104，不是HIV复制所必需的，但抑制由HIV LTR特异性转录的HIVI前病毒基因的表达。第102页/共191页烷基化后定位于细胞膜上的Nef蛋白比未烷基化并弥散于细胞核及细胞质内的Nef蛋白抑制HIVI基因表达的效率高10倍，推测Nef可能是通过膜细胞信使分

40、子获得对HIV LTR的调控作用。第103页/共191页（5）Vpr蛋白。又称病毒R蛋白，由96个氨基酸组成，存在于病毒颗粒中但不是HIV复制所必需的。含有vpr 基因的HIV毒株与无vpr基因的毒株相比，前者在细胞中生长较快，引发细胞病变也较强。Vpr蛋白可作用于HIVI的LTR区，提高HIV复制速度2-3倍，说明Vpr在病毒早期侵染中有作用。第104页/共191页（6）Vpu蛋白。HIVI特有的膜定位蛋白，编码由81个氨基酸组成的磷酸化蛋白，称为病毒U蛋白。Vpu蛋白的翻译受Rev调控。HIV复制时并不需要vpu基因表达，但若缺失该基因，感染性病毒粒子的产量降低5-10倍，并减少病毒颗粒在

41、细胞膜上的释放。推测该蛋白有利于HIV I病毒粒子的组装、成熟和释放，有助于gp160/CD4复合体的解聚。第105页/共191页（7）Vif蛋白。是相对分子质量为2.3104的病毒感染性因子，为HIVI侵染所必需。缺失vif基因的HIVI虽仍在细胞内正常复制并产生病毒粒子，但其侵染性不及野生HIVI病毒粒子的1/1000。Vif蛋白是病毒在巨噬细胞扩散所必须的。第106页/共191页HIV基因组不到10kb，起调控作用序列不超过其因组总长度的1/10，但是它的调控却非常复杂。病毒编码的调控因子以及宿主细胞调控因子之间，调控因子与顺式元件之间的相互作用保持了HIV基因表达的动态平衡。第107页

42、/共191页9-20 9-20 TatTat、RevRev和NefNef对HIVHIV基因表达的影响分析 第108页/共191页9.2.5 HIV9.2.5 HIV的感染及致病机理HIVHIV感染人体后立即复制和扩散，血清中出现HIVHIV抗原，外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞中均能分离出HIV,HIV,是HIVHIV原发感染的急性期。70%70%以上的原发感染者在感染后2-42-4周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大、关节痛、中枢及外周神经系统病变、皮肤斑丘疹、粘膜溃疡等，持续1-21-2周后进入HIVHIV感染的无症状潜伏期。第109页/共191页无症状潜伏期（可长达数年）。此时无

43、任何临床症状，外周血中HIVHIV抗原含量很低甚至检测不到。随感染时间的延长，HIVHIV重新开始大量复制并造成免疫系统损伤。临床上病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病（PGLPGL）、艾滋病相关综合症（APCAPC）等，直至发展到艾滋病。第110页/共191页HIVHIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可通过以下几种途径导致免疫功能下降：HIVHIV粒子表面的gp120gp120蛋白脱落，与正常细胞膜上CDCD4 4受体结合，使该细胞被免疫系统误认为病毒感染细胞而遭杀灭；因T T细胞CDCD4 4受体被gp120gp120封闭，影响了其免疫辅助功能；第111页/共191页HIVHIV的

44、gp120gp120蛋白可刺激机体产生抗CDCD4 4结合部位的特异性抗体，阻断T T细胞功能；带有病毒包膜蛋白的细胞可与其他细胞融合形成多核巨细胞而丧失功能。第112页/共191页9.2.6 9.2.6 艾滋病的治疗及预防迄今为止仍无任何药物可以完全抑制HIVHIV在感染者体内的增殖并彻底治愈艾滋病。目前主要用核苷酸型和非核苷酸型反转录酶抑制 来进行治疗。第113页/共191页第114页/共191页（a）核苷酸型反转录酶抑制剂。由于它在结构上与脱氧核苷酸的相似性，掺入后使病毒DNA的合成不能进行。（b）非核苷酸型反转录酶抑制剂。与反转录酶相结合，通过限制该酶的移动性而影响它的活性。第115页

45、/共191页9.3 9.3 乙型肝炎病毒HBVHBV病毒性肝炎是严重威胁人类健康的世界性传染病，引起肝炎的病毒通称肝炎病毒（hepatitis virushepatitis virus）。目前已经知道的至少有甲肝病毒（HAV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、丁肝病毒（HDV）和戊肝病毒（HEV）等5 5种病毒。第116页/共191页甲肝病毒属小RNARNA病毒科，乙肝病毒属嗜肝病毒科，丙肝病毒与黄热病毒和瘟病毒相似，为RNARNA病毒。丁肝病毒基因组由单链环状RNARNA分子组成，其外壳能识别乙肝病毒的表面抗原，是一种与乙肝有关的缺陷型病毒，需要有HBVHBV的辅助才能复制增殖。戊肝

46、病毒基因组为单链正链有多聚(A)RNA(A)RNA，球形无包膜。第117页/共191页9.3.1 9.3.1 肝炎病毒的分类及病毒粒子结构19861986年，国际病毒命名委员会正式将乙肝病毒定为嗜肝DNADNA病毒科成员，19901990年又将该科病毒分为正嗜肝病毒属和禽嗜肝病毒属，乙肝病毒是正嗜肝病毒属成员。第118页/共191页HBVHBV完整粒子的直径为42nm42nm，由外膜和核壳组成，有很强的感染性。其外膜由病毒的表面抗原、多糖和脂质构成；核壳直径27nm27nm，由病毒的核心抗原组成，并含有病毒的基因组DNADNA、反转录酶和DNADNA结合蛋白等。第119页/共191页图9-22

47、 HBV9-22 HBV病毒粒子模型图 第120页/共191页9.3.2 乙肝病毒基因组及其所编码的主要蛋白1、基因组结构乙肝病毒的基因组是有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长度不同。长链L（3.2kb）为负链，而短链S为正链，长度不确定，约为负链的50%-80%。基因组依靠正链5端约240bp的粘性末端与负链缺口部位的互补维持环状结构。第121页/共191页在两条链的互补区两侧各有一个11碱基的直接重复序列（5TTCAC-CTCTGC-3），分别开始于第1842和1590核苷酸处，称为DR1和DR2。图9-23 HBV基因组结构（ayw株）。第122页/共191页第123页/共191

48、页自19791979年第一次克隆和测定HBV aywHBV ayw亚型全基因组序列以来，已有2020多个不同HBVHBV基因组被测定。不同亚型中核苷酸水平的变异约为10%10%左右。同亚型中变异约为2%2%，最高达12%12%。HBVHBV基因组的多态性是该病毒高变异率的分子基础，其生物学意义是近年来HBVHBV研究中的热点之一。第124页/共191页2、HBV转录产物HBV基因组结构的最大特点是功能单位非常密集，基因组高度压缩，编码区重复利用，被称之为经济型基因组。它的核酸序列全部是蛋白编码区。HBV在感染过程中分别产生3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.8kb 4 种转录产物有多聚(A

49、)尾巴。第125页/共191页3.5kb和2.1kb转录物由L链而来，2.4kb和0.8kb转录物由S链转录。3.5kb mRNA编码核心蛋白，其3末端与2.1kb mRNA的3末端相同，比HBV基因组L链的全长还多200bp以上，推测它的末端部分可能来自共价闭合的双链区。第126页/共191页2.4kb mRNA编码S蛋白，2.1kb mRNA编码原S1和S2蛋白，而0.8kb mRNA编码X蛋白。上述4种转录产物在病毒感染的细胞中相对含量有明显差异，其中3.5kb和2.1kb mRNA的转录量远远高于2.4kb和0.8kb mRNA。第127页/共191页3 3、HBVHBV基因转录的调控

50、（1 1）顺式作用元件。HBVHBV的4 4种转录产物虽然有不同的55末端，但都利用同一终止信号和多聚(A)(A)位点。C C启动子调控3.5kb mRNA3.5kb mRNA的转录起始，在1705-1705-18051805位核苷酸处。其下游还发现一个有启动子功能的区域，不同的3.5kb mRNA3.5kb mRNA可由不同的启动子控制。启动子上存在类似TATATATA的序列。第128页/共191页SP1启动子位于-8977核苷酸处，调控2.4kb mRNA的转录起始。含有典型的TATA序列以及与该序列相距45个碱基的肝细胞特异性转录因子HNF1结合位点。HNF1的结合是SP1启动子在分化的