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1、第九章第九章分子生物学研究方法分子生物学研究方法1 1课程教学内容课程教学内容(1)核酸技术 1基本操作(2)核酸技术 2克隆技术(3)核酸技术 3测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2 2课程重点、难点课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3 3课程教学要求课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。本章内容本章内容核酸的凝胶电泳DNA 分子的酶切割核酸的分子杂交基因扩增基因的克隆和表达细菌的转化DNA 核苷酸序列分析蛋白质的分离与纯化研究 DNA
2、与蛋白质相互作用的方法一、一、核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这个意义上讲，DNA 和 RNA 的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的这种迁移率，取决于核酸分
3、子本身大小和构型。分子量较小的 DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环 DNA 分子或线性 DNA 分子要快些。Gel matrix(胶支持物)is an inserted,jello-like porous material that supportsand allows macromolecules to move through.Agarose(琼脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of
4、up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes,such as ethidiumbromide(EB 溴化乙锭)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):(1)has high resolvingcapability,and canresolve DNA that differ fromeachother as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow siz
5、e range(1 to a few hundredbp).Pulsed-field gel electrophoresis(脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally(直角地)to each other.(2)Separate DNA moleculesaccording to theirmolecule weight,as well astotheir shape and topological properties.(3)Can effectively separate DN
6、A molecules over 30-50 kb and up to severalMb in length.二、二、DNADNA 分子的酶切割分子的酶切割Restriction endonucleases(限制性内切酶)cleave DNA molecules at particularsitesRestriction endonucleases(RE)are the nucleases that cleave DNA at particularsites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biolo
7、gy typically recognize(识别)short(4-8bp)targetsequences that are usually palindromic(回文结构),and cut(切割)at a definedsequence within those sequences.e.g.EcoRIThe random occurrence of the hexameric(六核苷酸的)sequence:1/4096 (4-6=1/46)(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity:target sites ar
8、edifferent.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized,and thus thefrequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate:blunt/flush ends(平末端),sticky/staggered ends(粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交三、核酸的分子杂交原
9、理：带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的 DNA 或 RNA 分子，都是在杂交之前，通过毛细血管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去。常用的滤膜有尼龙膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸和二乙氨基乙基纤维素滤膜核酸杂交通常包括两个步骤：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移第二，将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的
10、DNA 或 RNA 探针进行杂交。Southern Blotting：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA 片段，这种实验方法叫做 DNA 印迹杂交技术。是由 E.Southern 于 1975 年首先设计出来的，故又叫做 Southern DNA 印迹技术。Northern Blotting1979 年，J.C.Alwine 等人发展出的一种用于 RNA 杂交的新方法。将电泳凝胶中的RNA 转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一
11、起。称为 Northern Blotting将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白的抗体反应，这种技术叫做 Western Blotting.定义：将 RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。斑点印迹杂交（dot Blotting）：基本原理和操作步骤是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后同 Southern 印迹一样的方式同核酸探针分子杂交。菌落（噬菌斑）杂交：1975 年，Mgrunstein 和 D Hogness 根据检测重组体 DNA 分子
12、的核酸杂交技术原理，对 Southern 吸引技术做了一些修改，发展出了一种杂交技术。在 1977 年，W.D.Benton 和 R.W.Davis 又发展出了与此类似的筛选含有克隆 DNA 噬菌体的杂交技术。菌落杂交或噬菌斑杂交有时也叫做原位杂交，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA 变性和杂交。四、四、基因扩增基因扩增基因扩增的五个方面的内容：第一，在体外应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）技术和合成的寡核苷酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。第二，通过体外 DNA 重组，将目的基因
13、插入到高拷贝数的质粒载体分子上，并转化到适当的寄主细胞，于是在体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。第三，在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因的产生和明显的扩增。第四，程序基因扩增第五，在生物的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关基因在基因组上聚集成簇。聚合酶链式反应：是美国 Cetus 公司人类遗传研究室的科学家 K B Mullis 于 1983 年发明的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。PCR 技术的基本原理：首先使双链的 DNA 分子变性为单链 DNA 分子然后 DNA 聚合酶以单链
14、DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互补链。DNA 聚合酶需要有一小段双链 DNA 来启动新链的合成。因此新合成的 DNA 链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板 DNA 链两端的退火决定的。在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链都可以作为合成新生互补链的模板。在每一条新合成的 DNA 链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新旧链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA 合成和链的分离。PCR 反应的最后结果是，经过几次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA 分子数，即两条引物结合位点之间的 DNA 区
15、段的拷贝数，理论上的拷贝数 2n.PCR 技术的两个特点：第一，能够知道特定DNA 序列的合成；第二，特定的DNA 区段得到了迅速大量的扩增。例如，经过 30 次循环，便可使靶 DNA 得到 109 倍的扩增。PCR 反应及多次重复进行的温度周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤：首先是将含有待扩增 DNA 样品的反应混合物放置在高温环境加热 1 分钟，使双链 DNA 发生变性，分离出单链的模板 DNA；然后降低反应温度使专门设计的一对寡核苷酸引物与两条单链模板 DNA 发生退火作用，结合在靶 DNA 区段两端的互补序列位置上；最后，将反应混合物的温度上升到 7
16、2 度左右保温 1.5 分钟,这时在DNA 聚合酶的作用下，链得到延伸。寡核苷酸引物：引物长度：通常在 15-30mers简并引物：是一类由寡核苷酸组成的混合物，彼此仅有一个或几个核苷酸的差异。嵌套引物Taq DNA 聚合酶：Klenow 片段热敏感，易失活；反应温度低，出现错配碱基；1986 年，从 75 度的热泉中的细菌中分离纯化出 Taq 酶。与大肠杆菌 DNA 聚合酶相比，Taq 酶使PCR 的特异性和敏感性高PCR 技术的应用：基因组克隆、反向 PCR 和染色体步移、不对称 PCR 与 DNA 序列测定、RT-PCR 与 RNA 分析、基因的体外诱变、基因组的比较研究五、基因的克隆和
17、表达五、基因的克隆和表达Processes(过程)of DNA cloning：1）Form the recombinant DNA molecules(重组 DNA)by inserting your interestedDNA fragments into a proper vector(载体).(Require restriction enzymes andligase)2）Transform(转化)the recombinant DNA molecules into competent cells(感受态细胞).3）Propagation of the cells containing
18、 the recombinant DNA to form a clone(克隆),a set of identical cells containing the same recombinant DNA.4）Select the desired clones using the selective marker.5）Host organisms/cells（宿主）:where the plasmids get multiplied andpropagated faithfully,which is crucial for DNA cloning.-Prokaryotic host(原核宿主):
19、E.coli(most cases)-Eukaryotic host（真核宿主）:YeastSaccharomycescerevisiae(large fragmentsof human genome)General features of a Vector（作为载体的一般特征）：1）They contain an originof replication and can autonomously replicating DNA independent of hosts genome.2）Easily to be isolated from the host cell.Most are cir
20、cular,some are linear(e.g.YAC vector).3）Contains at least one selective marker,which allows hostcells containing the vector to be selected amongst those which do not.4）Containsa multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for DNAmanipulation.Cloning vectors(克隆载体):allowing the exogenou
21、s DNA to be inserted,stored,and manipulated at DNA level.E.coli cloning vector(circular):plasmids(质粒)、bacteriophages(l and M13)(噬菌体)、plasmid-bacteriophage l hybrids(cosmids)(考斯质粒质粒和噬菌体杂和体)。Yeast cloning vector:yeast artificial(Linear)。Plasmids:small,extrachromosomal circular molecules,from 2 to 200
22、kb in size,which exist in multiple copies within the host cells.Contain an origin of replication（复制起点）,at least one selective marker（选择标记）and multiple cloning site（多克隆位点）.Example of selective marker:ampr gene encoding the enzyme b-lactamse whichdegrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨苄
23、）The commonly used plasmid are small in size(3 kb)Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNAlibrary)：A DNA library(DNA文库)is a population of identical vectors that each containsa different DNA insert.Genomic Library(基因组文库):the DNA inserts in a DNA library is derived
24、 fromrestriction digestion or physical shearing of the genomic DNA.cDNA library(cDNA 文库):the DNA inserts in a DNA library is converted from themRNAs of a tissue,a cell type or an organism.cDNA stands for the DNA copiedfrom mRNA.chromosomes(YACs，酵母人工染色体)cDNA library generation：The mRNAs are firstly r
25、everse transcript into cDNA,andthese cDNA,both full length and partial,are cloned to make the cDNA library.Colony screening：1）Antibiotic screening(抗生素选择)：only the recombinant plasmids grow on theantibiotic-containing plate.2）Blue-white screening(蓝白斑选择):DNA insertionin the vector shuts down the LacZ
26、gene expression,and turns the colony（菌落）to white.3）Colony hybridization screening(菌落杂交筛选)from a library.Analysis of a clone：1）Restriction mapping:digestion of the plasmid preparedfrom a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA isinserted the recombinant plasmid.2）Sequencin
27、g the cloned DNA to see if theinserted DNA maintains the correct sequence.六、细菌的转化六、细菌的转化转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的 DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。感受态：处于感受态的细胞，某种蛋白能够同核酸作用的复合形式。大肠杆菌的转化：1）用 CaCl2 处理大肠杆菌细胞，制备感受态细胞；2）将正在生长的大肠杆菌在 0 度下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）；3）同加入在转化混合物中的质粒 DNA 形成一种粘着在细胞表面上的对 Dnase 抗性的复合物。4
28、）转移到42 度下作短暂的热应激，这种复合物便会被细菌吸收；5）在富裕培养基中生长一段时间，再涂布在选择性的培养基中分离转化子。细菌转化效率影响细菌转化效率的因素：DNA 浓度、纯度和构型，转化细胞的生理状态及其在 CaCl2处理和贮藏之后的成活率，以及转化的环境条件（温度、PH 值、离子浓度）。环型的质粒 DNA 分子进入细胞，能够抗御细胞中固有的核酸酶的作用，而线性的 DNA分子，则对自由末端的降解作用是极其敏感的，环型 DNA 比线性的高出 10-100 倍。对于同样的转化 DNA 而言，大分子量的转化效率要比小分子量的低一些。以每微克质粒 DNA 出现的转化子菌落数表示的转化频率。应用
29、与大肠杆菌转化程序相类似的方法，也可以成功地转化各种真核细胞，将酵母用酶处理消化细胞壁之后，就会变成原生质体在具有 PEG 和 CaCl2 的转化反应体系中，让酵母原生质体同转化 DNA 接触，那么由于原生质体在生理上得到恢复并再生出细胞壁后，将其涂布在选择性培养基上便可以鉴定出转座子。七、七、DNADNA 核苷酸序列分析核苷酸序列分析1、Sanger 双脱氧链终止法：利用 DNA 聚合酶和双脱氧链终止物测定 DNA 核苷酸顺序的方法，是由英国科学家Sanger 等 1977 年发明的。其基本原理是利用了 DNA 聚合酶所具有的两种酶催化反应的特性：第一，DNA 聚合酶能够利用单链的 DNA
30、作模板，合成出其互补链；第二，DNA 聚合酶能够利用 2,3-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的 3末端，从而终止链的生长。2）Maxam-Gilbert 化学修饰法：原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的 DNA 片段，造成碱基的特异性切割，由此产生不同长度的链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，便可根据 x光片底版上所显现的相应谱带，直接读出待测 DNA 片段的核苷酸序列。3）DNA 杂交测序：步骤：将待测定的靶 DNA 分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交；对能够同靶 DNA分子形成完全双链体分子之间的碱基重叠关系比较分析，并据此推算靶DNA的核苷酸
31、序列结构。八、八、蛋白质相关技术蛋白质相关技术Protein purification(蛋白质纯化)、Affinity chromatography can facilitatemore rapid protein purification(亲和层析纯化)、Protein separation by PAGE gelelectrophoresis(蛋白质分离)and identification by Western analysis、Proteinsequencing(蛋白质测序)、Proteomics(蛋白质组学)。九、研究九、研究 DNADNA 与蛋白质相互作用的方法与蛋白质相互作用的方
32、法凝胶阻滞试验DNaseI 足迹实验甲基化干扰实验凝胶阻滞试验：凝胶阻滞试验：又叫 DNA 迁移率变动实验（DNA mobility shift assay）,是 1980 年代初出现的用于体外研究与蛋白质相互作用的一种特殊的电泳技术。当 DNA 分子结合上一种蛋白质,由于分子量加大在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正极移动的距离相应的缩短了。所以当特定的 DNA 片段同细胞提取物混合之后，如果其在凝胶中的距离缩小了说明它同细胞提取物中的某种特殊的蛋白质分子发生了结合作用。DNaseIDNaseI 足迹实验足迹实验是一类用于检测与特定的蛋白质结合的 DNA 序列及特性的专门技术足迹实验的一个明显的优点是可以形象地展示出一种特殊的蛋白因子同特定 DNA片段之间的结合区域。甲基化干扰实验（methylation interference assay）根据 DMS 能够使 G 残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的 G 残基这一原理还设计出另一种研究 DNA 与蛋白质相互作用的实验方法。甲基化干扰试验的具体操作：先用 DMS 处理靶 DNA，并控制反应条件，使之达到平均每条 DNA 分子只有一个 G 残基被甲基化；而后将这些局部甲基化的 DNA 群体同含有 DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并做凝胶阻滞试验。